JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

एक इन विट्रो परख के विकास के लिए Quantitate टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं (HSPCs) Zebrafish भ्रूण के विकास में

Published: November 30, 2017
doi:
10.3791/56836
,
1Department of Biological Sciences,California State University, Chico

Summary

यहाँ, हम भ्रूण zebrafish में टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं (HSPCs) quantitate करने के लिए एक सरल विधि प्रस्तुत करते हैं । असंबद्ध zebrafish से HSPCs सहायक कारकों के साथ methylcellulose में चढ़ाया जाता है, परिपक्व रक्त में अंतर । यह रक्त दोषों का पता लगाने की अनुमति देता है और दवा स्क्रीनिंग आसानी से आयोजित किया जा करने के लिए अनुमति देता है ।

Abstract

Hematopoiesis एक आवश्यक सेलुलर प्रक्रिया है जिसमें टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं (HSPCs) अलग कोशिका वंश कि परिपक्व रक्त शामिल की भीड़ में अंतर है । अलगाव और इन HSPCs की पहचान मुश्किल है क्योंकि वे पूर्व पोस्ट वास्तविकपरिभाषित कर रहे हैं; वे केवल विशिष्ट कोशिका वंश में उनके भेदभाव के बाद परिभाषित किया जा सकता है । पिछले कुछ दशकों से zebrafish (ढाणियो rerio) hematopoiesis का अध्ययन करने वाला एक मॉडल जीव बन गया है । Zebrafish भ्रूण पूर्व uteroविकसित, और द्वारा ४८ ज बाद निषेचन (hpf) निश्चित HSPCs. परख पैदा की है HSPC भेदभाव और प्रसार क्षमताओं का आकलन करने के लिए विकसित किया गया है, प्रत्यारोपण और बाद का उपयोग टेम प्रणाली का पुनर्गठन फोकल माइक्रोस्कोपी के साथ विशेष ट्रांसजेनिक लाइनों visualizing के अलावा । हालांकि, इन परख लागत पर प्रतिबंधक हैं, तकनीकी रूप से मुश्किल है, और कई प्रयोगशालाओं के लिए समय लगता है । एक इन विट्रो मॉडल के विकास HSPCs का आकलन करने के लिए प्रभावी लागत, जल्दी होगा, और कम कठिनाइयों पहले वर्णित विधियों की तुलना में वर्तमान, प्रयोगशालाओं जल्दी mutagenesis और दवा स्क्रीन है कि HSPC जीव विज्ञान को प्रभावित का आकलन करने के लिए अनुमति देता है । इस उपंयास इन विट्रो परख HSPCs का आकलन करने के लिए असंबद्ध पूरे zebrafish भ्रूण चढ़ाना और exogenous कारकों है कि केवल HSPC भेदभाव और प्रसार को बढ़ावा देने के द्वारा किया जाता है । भ्रूण एकल कोशिकाओं में असंबद्ध और HSPC के साथ चढ़ाया सहायक कॉलोनी कारकों उत्तेजक है कि उंहें पैदा करने के लिए कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFUs) है कि एक जनक सेल से पैदा उत्तेजित । इन परख आणविक HSPC प्रसार, भेदभाव के लिए जिंमेदार रास्ते के और अधिक सावधान परीक्षा की अनुमति चाहिए, और विनियमन है, जो शोधकर्ताओं हड्डीवाला hematopoiesis और उसके dysregulation के आधार समझने के लिए अनुमति देगा रोग के दौरान ।

Introduction

Hematopoiesis एक जीव के अस्तित्व के लिए आवश्यक परिपक्व रक्त कोशिकाओं की भीड़ बनाने की प्रक्रिया है । यह एक महत्वपूर्ण विकास प्रक्रिया है कि विकास के लिए प्रतिबंधित कोशिका प्रकार है कि परिपक्व रक्त शामिल की एक किस्म में टेम स्टेम सेल (HSCs) के भेदभाव शामिल है । इन HSCs आत्म नवीकरण करना चाहिए ताकि प्रणाली कभी नहीं थक गया है और वे जल्दी भ्रूण विकास से मृत्यु तक बनाए रखना चाहिए । रीढ़ में, लगातार भेदभाव और टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं (HSPCs) के प्रसार के लिए पर्याप्त रूप से रक्त कोशिकाओं है कि पोस्ट कर रहे है के बहुमत की भरपाई की जरूरत है mitotic और हर दिन पुनर्नवीनीकरण किया जा रहा है । HSCs पहले प्रतिबंधित जनक कोशिकाओं के उपसमुच्चय में अंतर से परिपक्व रक्त कोशिकाओं उत्पन्न; आम लसीकावत् progenitors (CLPs)1, जो अंततः टी, बी, और NK कोशिकाओं का उत्पादन, और आम माइलॉयड progenitors (CMPs)2 कि उत्पन्न granulocytes, एरिथ्रोसाइट्स, मैक्रोफेज, और megakaryocytes. इन progenitors विशिष्ट कोशिका वंश पैदा करने के लिए प्रतिबद्ध हैं, और आगे ऐसी माइलॉयड erythroid progenitors (MEPs) के रूप में अधिक विकास प्रतिबंधित जनक कोशिकाओं में अंतर है कि एरिथ्रोसाइट्स और प्लेटलेट्स उत्पन्न, या granulocyte macrophage progenitors (GMPs) जो बेसोफिल, इयोस्नोफिल्स, न्यूट्रोफिल, और मैक्रोफेज2उत्पन्न करता है । पहचान और अलग इन progenitors टेम भेदभाव में शामिल महत्वपूर्ण आणविक रास्ते की पहचान की अनुमति देता है और ल्यूकेमिया जैसे कई टेम रोगों उठता है जब इन जनक कोशिकाओं को ठीक करने के लिए असफल अंतर.

पिछले कुछ दशकों में, zebrafish (ढाणियो rerio) मॉडल प्रणाली भ्रूण और वयस्क टेम अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण अनुसंधान उपकरण बन गया है । Zebrafish आनुवंशिक विश्लेषण के लिए उत्तरदायी हैं और phylogenetically निम्नतम हड्डीवाला मॉडल प्रजातियाँ हैं जो मनुष्यों को एक समान vasculature और टेम प्रणाली है. Zebrafish भ्रूण पूर्व utero विकसित, और ४८ घंटे के भीतर निषेचन के बाद (hpf) उत्पंन HSPCs3,4,5,6,7,8। Zebrafish भी अत्यधिक उपजाऊ हैं, महिलाओं के साथ एक ही क्लच में १०० से अधिक अंडे बिछाने, बड़े नमूना आकार और प्रयोगात्मक प्रतिकृति के लिए अनुमति देता है । Zebrafish भ्रूण ऑप्टिकली पारदर्शी हैं, टेम प्रणाली के सूक्ष्म दृश्य के लिए अनुमति देता है । zebrafish के कई फ्लोरोसेंट ट्रांसजेनिक लाइनें ऐसी runx1के रूप में HSCs अंकन: EGFP मछली9, cd41: EGFP मछली10, और kdrl:mCherry; cmyb: GFP3 डबल पॉजिटिव जानवरों, जीने के लिए अनुमति देते हैं, HSC उद्भव और विस्तार vivo3,4,7,8, 9. है zebrafish त्वरित पीढ़ी के समय और विकास के पूर्व utero mutagenesis अध्ययन में इसके उपयोग के लिए नेतृत्व किया है11,12,13,14,15 और नशीली दवाओं स्क्रीनिंग16,17,18,19,20 यौगिकों कि मानव रक्त विकारों के लिए चिकित्सीय वादा पकड़ के लिए । कुल मिलाकर, टेम प्रणाली के संरक्षण, उपस्थिति और ट्रांसजेनिक लाइनों के आसान विकास, और जल्दी पुनर्जनन समय zebrafish एक सस्ती, जल्दी, लचीला है, और टेम अध्ययन के लिए आदर्श मॉडल बना दिया है ।

अलग और परीक्षण HSCs के कई तरीकों स्तनधारी टेम प्रणालियों में विकसित किया गया है । जांचकर्ताओं HSCs21,22,23,24, के रूप में अच्छी तरह से समाप्ति डाई25,26के लिए HSCs की क्षमता का दोहन करने के लिए चिह्नित करने के लिए सेल सतह रिसेप्टर्स का एक संयोजन का उपयोग कर सकते हैं । वे लेबल कर रहे हैं के बाद, प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष छँटाई (FACS) उनके शारीरिक जुदाई की अनुमति देता है. साबित करना है कि एक सेल एक HSC है radiating अंतर्जात HSPCs को नष्ट करने के लिए एक मेजबान जानवर की आवश्यकता है, ख्यात HSCs प्रत्यारोपण, और दीर्घकालिक, बहु सभी परिपक्व रक्त कोशिका प्रकार के वंश पुनर्गठन देख । इन परख चूहों में अच्छी तरह से काम करते हैं, के रूप में वहां कई सेल टेम कोशिकाओं और नस्ल माउस उपभेदों कि प्रत्यारोपण के लिए प्रतिरक्षा मिलान की सुविधा के खिलाफ सतह एंटीबॉडी रहे हैं । हालांकि, कुछ zebrafish टेम कोशिका-सतह एंटीबॉडी27उत्पंन किया गया है, पहचान और HSCs के अलगाव में बाधा । zebrafish HSCs को चिह्नित और अलग करने का सबसे आम तरीका ट्रांसजेनिक जानवरों के साथ है, जिससे एक कोशिका-विशिष्ट प्रवर्तक अनुक्रम एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति चला रहा है । अध्ययनों की कल्पना की है और इस तकनीक का उपयोग सूक्ष्मता के साथ पृष्ठीय महाधमनी के ventral दीवार में HSCs की गणना की है3,4,8,9। अंय प्रयोगशालाओं zebrafish28,29 के क्लोनिंग उपभेदों उत्पंन किया है और MHC-मिलान पशुओं30में सफल प्रत्यारोपण का प्रदर्शन । हालांकि, इन तकनीकों की लागत कई प्रयोगशालाओं के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं, तकनीकी रूप से मुश्किल है, और समय लगता है । इन मुद्दों को संबोधित करने के लिए, प्रयोगशालाओं की उपस्थिति के लिए परीक्षण करने के लिए इन विट्रो परख में कई उत्पंन किया है, प्रसार दर, और HSPCs31के भेदभाव की क्षमता,३२,३३, ३४,३५,३६. ये परख इन विट्रो31,३२,३३,३४,३५,३६, के बचाव में HSPCs के प्रसार और भेदभाव दिखाते हैं । टेम दोष३६, और खोज और परीक्षण के लिए एक कुशल विधि साइटोकिंस३३,३४,३५। वे भी HSPC जीवविज्ञान31,३२के लिए जिंमेदार जीन की पहचान करने के लिए उपयोग किया गया है । इस अध्ययन में, हम इन परख एक कदम आगे ले, एक विकासशील zebrafish भ्रूण में HSPCs के quantitation की अनुमति । इन परख भी उत्परिवर्ती पशुओं और टेम-विघटनकारी दवाओं के साथ इलाज जानवरों में HSPCs की संख्या quantitate करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । संक्षेप में, इन परख तेजी से कर रहे हैं, वर्तमान कुछ तकनीकी चुनौतियों, और HSPC संख्या quantitate करने के लिए सस्ती तरीके हैं, उनके प्रसार की जांच, और भेदभाव में ब्लॉक की जांच ।

Protocol

संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) कैलिफोर्निया राज्य विश्वविद्यालय में सलाहकार बोर्ड, चिको, सभी तरीकों को मंजूरी दे दी नीचे वर्णित है । 1. ब्लीच ४८ hpf Zebrafish भ्रूण 15 सेमी (डब्ल्यू) x 15 सेमी (ए?…

Representative Results

भ्रूण zebrafish में HSPC संख्या का आकलन करने के लिए, ४८ hpf भ्रूण पचा रहे थे, exogenous टेम के साथ methylcellulose में चढ़ाया-सहायक विकास कारकों, और 7 दिनों के लिए मशीन (चित्रा 1) । 7 दिनों के बाद, कॉलोनी बना…

Discussion

zebrafish मॉडल प्रणाली आदिम और निश्चित हड्डीवाला hematopoiesis के अध्ययन के लिए एक कुशल, प्रभावी, और सस्ती मॉडल बन गया है । परख की पीढ़ी है कि तेजी से कर रहे हैं, सस्ती, और वर्तमान कुछ तकनीकी कठिनाइयों छोटे अणुओं के परीक…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

धन स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा प्रदान की गई (NIH: K01-DK087814-01A1 D.L.S. के लिए), कैलिफोर्निया राज्य जैव प्रौद्योगिकी में शिक्षा और अनुसंधान के लिए विश्वविद्यालय कार्यक्रम (CSUPERB: हड्डीवाला टेम आला के आणविक नियंत्रण D.L.S. के लिए) और कैलिफोर्निया स्टेट यूनिवर्सिटी चिको (A.C.B. करने के लिए) में स्नातक अध्ययन कार्यालय से ।

Materials

10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM StemCell Technologies  9300
DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ Life Technologies 14080-055
HyClone PBS (1x) GE Healthcare Life Sciences sh30256.01
 DMEM 500 mL Corning CellGrow 10-017-CV
 Ham's F12 500 mL Corning CellGrow 10-080-CV
FBS 500 mL Gemini Bio-Products 100-108
HEPES 100 mL (1 M) Gibco life technologies 15-630-080
Penicillin/streptomycin (5000 U/mL
and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM)		 Corning Mediatech 30-009-CI
Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) Corning Mediatech 30-005-CR
1.5 mL MCF tube FisherBrand 05-408-129
3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock BD Safety Glide 305905
5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap Corning Falcon 352235
Methocel MC Sigma-Aldrich 64630
14 mL Polystyrene round bottom tube Corning Falcon 352057
10 mm polystyrene easygrip Petri dish Corning Falcon 351008
Librease TM Roche Sigma-Aldrich 5401119001 dissociation protease
Pronase Roche Sigma-Aldrich 11459643001 dechorionation protease
15 cm Petri dish Corning Falcon 351058
AB Zebrafish International Resource Center (ZIRC) ZL1 zebrafish strain used
Dithiolthreitol (DTT) Sigma-Aldrich 646563
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
  2. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
  3. Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
  4. Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
  5. Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
  6. Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
  7. Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
  8. Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
  9. Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
  10. Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
  11. Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
  12. Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
  13. Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
  14. Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
  15. Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
  16. Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
  17. Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
  18. Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
  19. North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
  20. Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
  21. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
  22. Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
  23. Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
  24. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
  25. Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
  26. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
  27. Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
  28. Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
  29. Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
  30. de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
  31. Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644 (2017).
  32. Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
  33. Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
  34. Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
  35. Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
  36. Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
  37. Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
  38. Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
  39. Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
  40. Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
  41. Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
  42. Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
  43. Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).

Tags

In Vitro AssayHematopoietic Stem CellsHematopoietic Progenitor CellsZebrafish EmbryosBlood Progenitor FormationGene KnockdownMorphantsBleachingDechorionationE3 Medium
check_url/56836?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Berrun, A., Stachura, D. Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (129), e56836, doi:10.3791/56836 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image