Utveckling av ett In Vitro -test att kvantifiera hematopoetiska stamceller och stamceller celler (HSPCs) utveckla zebrafiskar embryon
Summary
Här presenterar vi en enkel metod för att kvantifiera hematopoetiska stamceller och stamceller celler (HSPCs) i embryonala zebrafiskar. HSPCs från dissocierade zebrafiskar är klädd i metylcellulosa med stödjande faktorer, att differentiera in mogna blodet. Detta möjliggör detektion av blod defekter och tillåter drug screening för att utföras enkelt.
Abstract
Blodbildningen är en viktig cellulär process där differentieras hematopoetiska stamceller och stamceller celler (HSPCs) till mängden olika cell härstamningar som utgör mogen blod. Isolering och identifiering av dessa HSPCs är svårt eftersom de är definierade ex post facto; de kan endast fastställas efter deras differentiering till viss cell härstamningar. Under de senaste decennierna blivit zebrafiskar (Danio rerio) modellorganism att studera blodbildning. Zebrafiskar embryon utveckla ex uterooch av 48 h efter befruktning (hpf) har genererat slutgiltig HSPCs. analyser för att utvärdera HSPC differentiering och spridning kapacitet har utvecklats, utnyttja transplantation och efterföljande beredning av hematopoetiska systemet förutom att visualisera specialiserade transgena linjerna med konfokalmikroskopi. Dessa analyser är dock kostnaden oöverkomliga, tekniskt svårt och tidskrävande för många laboratorier. Utveckling av ett in vitro- modell för att bedöma HSPCs skulle vara kostnadseffektiv, snabbare, och innebära färre svårigheter jämfört med tidigare beskrivna metoder, som tillåter laboratorier att snabbt bedöma mutagenes och drog skärmar som påverkar HSPC biologi. Denna nya in vitro- analys att bedöma HSPCs utförs av plätering separerade hela zebrafiskar embryon och lägga exogena faktorer som främjar endast HSPC differentiering och spridning. Embryon är separerade i enstaka celler och klädd med HSPC-stödjande kolonin stimulerande faktorer som orsakar dem att generera kolonin bildar enheter (CFUs) som uppstår från en enda progenitor cell. Dessa testmetoder bör tillåta mer noggrann undersökning av de molekylära vägarna ansvarar för HSPC proliferation, differentiering och förordning, vilket gör att forskare att förstå grunderna för ryggradsdjur blodbildning och dess dysreglering under sjukdom.
Introduction
Blodbildningen är processen att göra mängden mogna blodkroppar krävs för organismens överlevnad. Det är en viktig utvecklande process som involverar differentiering av hematopoetiska stamceller (Förenta) in i en mängd utvecklingsmässigt begränsad celltyper som utgör mogen blod. Dessa Förenta måste själv förnya så att systemet är aldrig slut och de måste kvarstår från tidig embryonal utveckling tills döden. Hos ryggradsdjur, konstant differentiering och spridning av hematopoetiska stamceller och stamceller celler (HSPCs) behövs för att fylla på lämpligt sätt på majoriteten av blodkroppar som är efter mitotiska och återvinns varje dag. Förenta generera mogna blodkroppar första differentiera i underuppsättningar av begränsad stamceller; gemensamma lymfoida stamfäder (CLPs)1, som så småningom producera T, B och NK celler, och gemensamma myeloida (CMPs)2 som genererar granulocyter, erytrocyter, makrofager och megakaryocyter. Dessa stamfäder har åtagit sig att generera viss cell härstamningar och ytterligare differentieras till mer utvecklingsmässigt begränsad stamceller såsom myeloisk erytroid stamfäder (ledamöter) som genererar erytrocyter och trombocyter eller granulocyt makrofag stamfäder (god tillverkningssed) som genererar basofiler, eosinofiler, neutrofiler och makrofager2. Att identifiera och isolera dessa stamfäder möjliggör identifiering av viktiga molekylära vägar inblandade i hematopoetiska differentiering och många hematopoetiska sjukdomar som leukemi uppstår när dessa stamceller inte korrekt differentiera.
Under de senaste decennierna, har zebrafisk (Danio rerio) modell systemet blivit en viktig forskningsverktyg för embryonala och vuxen hematopoetiska studier. Zebrafisk är mottagliga för genetisk analys och de fylogenetiskt lägsta ryggradsdjur modell arter som har en liknande vaskulatur och hematopoetiska systemet till människor. Zebrafiskar embryon utveckla ex utero, och inom 48 timmar efter befruktning (hpf) generera HSPCs3,4,5,6,7,8. Zebrafisk är också mycket fruktsam, med honor om över 100 ägg i en inre koppling, möjliggör stora urvalsstorlekar och experimentella replikering. Zebrafiskar embryon är optiskt transparenta, vilket möjliggör mikroskopiska visualisering av det hematopoetiska systemet. Flera fluorescerande transgena linjerna av zebrafisk märkning Förenta såsom runx1: andra fisk9, cd41: andra fisk10, och kdrl:mCherry; cmyb: GFP3 dubbel-positiva djur, Tillåt för levande, realtid visualisering av HSC framväxt och expansion i vivo3,4,7,8, 9. Den zebrafiskar snabb generation tid och utveckling ex utero har lett till dess användning i mutagenes studier11,12,13,14,15 och drog screening16,17,18,19,20 för föreningar som håller terapeutiska löfte för mänskliga blodsjukdomar. Bevarande av det hematopoetiska systemet, närvaro och enkel utveckling av transgena linjerna och snabb Renbränningstid har sammantaget gjort zebrafiskar en billig, snabb, flexibel och perfekt modell för hematopoetiska studier.
Många metoder att isolera och testning Förenta har utvecklats i däggdjur hematopoetiska system. Utredarna kan utnyttja en kombination av cellernas yta receptorer att markera Förenta21,22,23,24, samt utnyttja Förenta förmåga att efflux dye25,26. När de är märkta, kan fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) deras fysiska separation. Bevisar att en cell är en HSC kräver bestråla en värddjuret för att förstöra endogena HSPCs, omplantering förmodad Förenta, och observera långsiktiga, multi härstamning beredning av alla mogna blodkroppar typer. Dessa analyser fungerar bra i möss, som det finns många cellytan antikroppar mot hematopoetiska celler och inavlade mus stammar som underlättar immun matchande för transplantation. Några zebrafiskar hematopoetiska cellytan antikroppar har dock genererat27, hindra identifiering och isolering av Förenta. Det vanligaste sättet att markera och isolera zebrafiskar Förenta är med transgena djur, whereby en cell-specifika promotorn sekvens driver ett fluorescerande protein uttryck. Studier har visualiseras och uppräknade Förenta i ventrala väggen av dorsala aorta med mikroskopi utnyttja denna teknik3,4,8,9. Andra laboratorier har genererat klonal stammar av zebrafisk28,29 och har genomfört framgångsrika transplantationer i MHC-matchade djur30. Dock dessa tekniker är kostnadseffektivt oöverkomliga många laboratorier är tekniskt svåra och är tidskrävande. För att lösa dessa frågor, har laboratorier genererat flera in vitro- analyser att testa för närvaro, de spridning priserna och differentiering kapacitet HSPCs31,32,33, 34,35,36. Dessa analyser visar proliferation och differentiering av HSPCs in vitro-31,32,33,34,35,36, rädda hematopoetiska defekter36, och en effektiv metod för att upptäcka och testa cytokiner33,34,35. De har också använts för att identifiera gener som ansvarar för HSPC biologi31,32. I denna studie tar vi dessa analyser ett steg längre, så att kvantitering av HSPCs i en växande zebrafiskar embryot. Dessa analyser kan också användas för att kvantifiera antalet HSPCs i muterade djur och djur behandlas med hematopoetisk-störande droger. I huvudsak dessa analyser är snabb, nuvarande några tekniska utmaningar, och är billigt sätt att kvantifiera HSPC nummer, undersöka deras spridning och undersöka block i differentiering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafisk modellen systemet har blivit en effektiv, effektiv och billig modell för att studera primitiva och slutgiltiga ryggradsdjur blodbildning. Generation av analyser som är snabb, billig och presentera några tekniska svårigheter kan utnyttjas för testning små molekyler, analysera mutant embryon och klarlägga molekylära vägar viktigt för HSPC biologi. In vitro plätering av HSPCs från vuxna zebrafiskar är en effektiv metod att studera mutagenes, cytokiner och hematopoetiska defekter. Detta protok…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansieringen tillhandahölls av National Institutes of Health (NIH: K01-DK087814-01A1 till D.L.S.), California State University programmet för utbildning och forskning inom bioteknik (CSUPERB: molekylär kontroll av Vertebrate hematopoetiska nisch till D.L.S.) och från Graduate Studies Office på California State University Chico (till A.C.B.).
Materials
| 10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM | StemCell Technologies | 9300 | |
| DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| DMEM 500 mL | Corning CellGrow | 10-017-CV | |
| Ham's F12 500 mL | Corning CellGrow | 10-080-CV | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HEPES 100 mL (1 M) | Gibco life technologies | 15-630-080 | |
| Penicillin/streptomycin (5000 U/mL and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM) |
Corning Mediatech | 30-009-CI | |
| Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) | Corning Mediatech | 30-005-CR | |
| 1.5 mL MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock | BD Safety Glide | 305905 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| Methocel MC | Sigma-Aldrich | 64630 | |
| 14 mL Polystyrene round bottom tube | Corning Falcon | 352057 | |
| 10 mm polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| Librease TM | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| 15 cm Petri dish | Corning Falcon | 351058 | |
| AB | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ZL1 | zebrafish strain used |
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 |
References
- Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404, 193-197 (2000).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464, 108-111 (2010).
- Kissa, K., Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature. 464, 112-115 (2010).
- Bertrand, J. Y., Kim, A. D., Teng, S., Traver, D. CD41+ cmyb+ precursors colonize the zebrafish pronephros by a novel migration route to initiate adult hematopoiesis. Development. 135, 1853-1862 (2008).
- Bertrand, J. Y., et al. Definitive hematopoiesis initiates through a committed erythromyeloid progenitor in the zebrafish embryo. Development. 134, 4147-4156 (2007).
- Ma, D., Zhang, J., Lin, H. F., Italiano, J., Handin, R. I. The identification and characterization of zebrafish hematopoietic stem cells. Blood. 118, 289-297 (2011).
- Lam, E. Y., Hall, C. J., Crosier, P. S., Crosier, K. E., Flores, M. V. Live imaging of Runx1 expression in the dorsal aorta tracks the emergence of blood progenitors from endothelial cells. Blood. 116, 909-914 (2010).
- Lam, E. Y., et al. Zebrafish runx1 promoter-EGFP transgenics mark discrete sites of definitive blood progenitors. Blood. 113, 1241-1249 (2009).
- Lin, H. F., et al. Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish. Blood. 106, 3803-3810 (2005).
- Driever, W., et al. A genetic screen for mutations affecting embryogenesis in zebrafish. Development. 123, 37-46 (1996).
- Weinstein, B. M., et al. Hematopoietic mutations in the zebrafish. Development. 123, 303-309 (1996).
- Ransom, D. G., et al. Characterization of zebrafish mutants with defects in embryonic hematopoiesis. Development. 123, 311-319 (1996).
- Amsterdam, A., et al. A large-scale insertional mutagenesis screen in zebrafish. Genes Dev. 13, 2713-2724 (1999).
- Gaiano, N., et al. Insertional mutagenesis and rapid cloning of essential genes in zebrafish. Nature. 383, 829-832 (1996).
- Yeh, J. R., et al. Discovering chemical modifiers of oncogene-regulated hematopoietic differentiation. Nat Chem Biol. 5, 236-243 (2009).
- Paik, E. J., de Jong, J. L., Pugach, E., Opara, P., Zon, L. I. A chemical genetic screen in zebrafish for pathways interacting with cdx4 in primitive hematopoiesis. Zebrafish. 7, 61-68 (2010).
- Ridges, S., et al. Zebrafish screen identifies novel compound with selective toxicity against leukemia. Blood. 119, 5621-5631 (2012).
- North, T. E., et al. Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature. 447, 1007-1011 (2007).
- Astuti, Y., et al. A Functional Bioluminescent Zebrafish Screen for Enhancing Hematopoietic Cell Homing. Stem Cell Reports. 8, 177-190 (2017).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Spangrude, G. J., Heimfeld, S., Weissman, I. L. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241, 58-62 (1988).
- Morrison, S. J., Weissman, I. L. The long-term repopulating subset of hematopoietic stem cells is deterministic and isolatable by phenotype. Immunity. 1, 661-673 (1994).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273, 242-245 (1996).
- Goodell, M. A., et al. Dye efflux studies suggest that hematopoietic stem cells expressing low or undetectable levels of CD34 antigen exist in multiple species. Nat Med. 3, 1337-1345 (1997).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Gansner, J. M., et al. Sorting zebrafish thrombocyte lineage cells with a Cd41 monoclonal antibody enriches hematopoietic stem cell activity. Blood. 129, 1394-1397 (2017).
- Smith, A. C., et al. High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia. Blood. 115, 3296-3303 (2010).
- Mizgirev, I., Revskoy, S. Generation of clonal zebrafish lines and transplantable hepatic tumors. Nat Protoc. 5, 383-394 (2010).
- de Jong, J. L., et al. Characterization of immune-matched hematopoietic transplantation in zebrafish. Blood. 117, 4234-4242 (2011).
- Wolf, A., et al. Zebrafish Caudal Haematopoietic Embryonic Stromal Tissue (CHEST) Cells Support Haematopoiesis. Sci Rep. 7, 44644 (2017).
- Campbell, C., et al. Zebrafish embryonic stromal trunk (ZEST) cells support hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) proliferation, survival, and differentiation. Exp Hematol. 43, 1047-1061 (2015).
- Svoboda, O., et al. Dissection of vertebrate hematopoiesis using zebrafish thrombopoietin. Blood. 124, 220-228 (2014).
- Stachura, D. L., et al. The zebrafish granulocyte colony-stimulating factors (Gcsfs): 2 paralogous cytokines and their roles in hematopoietic development and maintenance. Blood. 122, 3918-3928 (2013).
- Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118, 1274-1282 (2011).
- Stachura, D. L., et al. Zebrafish kidney stromal cell lines support multilineage hematopoiesis. Blood. 114, 279-289 (2009).
- Svoboda, O., et al. Ex vivo tools for the clonal analysis of zebrafish hematopoiesis. Nat Protoc. 11, 1007-1020 (2016).
- Paffett-Lugassy, N., et al. Functional conservation of erythropoietin signaling in zebrafish. Blood. 110, 2718-2726 (2007).
- Stachura, D. L., Traver, D. Cellular dissection of zebrafish hematopoiesis. Methods Cell Biol. 133, 11-53 (2016).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nat Immunol. 4, 1238-1246 (2003).
- Kobayashi, I., et al. Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue. Blood. 111, 1131-1137 (2008).
- Henninger, J., et al. Clonal fate mapping quantifies the number of haematopoietic stem cells that arise during development. Nat Cell Biol. 19, 17-27 (2017).
- Tamplin, O. J., et al. Hematopoietic stem cell arrival triggers dynamic remodeling of the perivascular niche. Cell. 160, 241-252 (2015).
