إنزيم TET2 انقسام هندسيا للحمض النووي الكيميائية إيندوسيبلي هيدروكسيميثيليشن ويعيد البناء جينية
Summary
وترد بروتوكولات مفصلة لإدخال إنزيم هندسيا سبليت-TET2 (عصير التفاح) في خلايا الثدييات هيدروكسيميثيليشن الحمض النووي إيندوسيبلي الكيميائية وإعادة عرض جينية.
Abstract
مثلايشن الحمض النووي هو تعديل جينية الموروثة ومستقر في الجينوم الثدييات وهو يشارك في تنظيم التعبير الجيني للتحكم في الوظائف الخلوية. عكس مثلايشن الحمض النووي، أو ديميثيليشن الحمض النووي، هو توسط إزفاء (TET) أحد عشر-عشرة عائلة البروتين ديوكسيجيناسيس. على الرغم من أن قيل على نطاق واسع أن الشاذة مثلايشن الحمض النووي و demethylation المرتبطة بعيوب التنموية والسرطان، كيف هذه التغيرات جينية تسهم مباشرة في التعديلات اللاحقة في تطور التعبير أو المرض الجيني لا تزال غير واضحة، إلى حد كبير نظراً لعدم وجود أدوات موثوق بها لدقة إضافة أو إزالة التعديلات الدنا في الجينوم بدقة زمنية ومكانية محددة. للتغلب على هذه العقبة، صممنا إنزيم سبليت-TET2 لتمكين التحكم الزمني للأكسدة 5-ميثيلسيتوسيني (5mC) ويعيد البناء اللاحقة للدول جينية في خلايا الثدييات ببساطة إضافة المواد الكيميائية. هنا، يمكننا وصف طرق لإدخال أداة يعيد epigenome كيميائية إيندوسيبلي (عصير التفاح)، استناداً إلى إنزيم هندسيا سبليت–TET2، في خلايا الثدييات، والتحديد الكمي لإنتاج المواد الكيميائية إيندوسيبلي 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC) مع إيمونوستاينينج، والتدفق الخلوي أو مقايسة دوت-وصمة عار. سوف تجد هذه الأداة epigenome الكيميائية إيندوسيبلي يعيد استخدام واسع النطاق في استجواب النظم الخلوية دون تغيير الشفرة الجينية، وكذلك في استكشاف العلاقات epigenotype−phenotype في مختلف النظم البيولوجية.
Introduction
مثلايشن الحمض النووي، معظمها يشير إلى إضافة مجموعة الميثيل بموقف السيتوزين الكربون 5 لتشكيل 5-ميثيلسيتوسيني (5mC)، وهو تحفزها الحمض النووي الميثيل-ترانسفيراسيس (دنمتس). 5mC بمثابة علامة جينية رئيسية في الجينوم الثدييات التي غالباً ما إشارات للقمع النسخي والمنظمة X-chromosome ينقول إسكات1. عكس مثلايشن الحمض النووي هو توسط الأسرة البروتين إزفاء (TET) 10-الجان. الإنزيمات التيت تنتمي للحديد (II) و 2-أوكسوجلوتاراتي ديوكسيجيناسيس تعتمد الذي حفز الأكسدة المتعاقبة من 5mC إلى 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC)، 5-فورميلسيتوسيني (إف سي 5) و 5-كاربوكسيسيتوسيني (5caC). ويفرض أكسدة 5mC تيت بوساطة طبقة إضافية من سيطرة جينية على الجينوم الثدييات. وقد آثار اكتشاف تيت اهتماما مكثفا في مجال جينية لكشف النقاب عن الوظائف البيولوجية للبروتينات تيت وبهم 5hmC المنتج الحافز الرئيسي. 5hmC ليس فقط كمادة وسيطة خلال تيت بوساطة نشطة الحمض النووي ديميثيليشن2،4من3،، ولكن أيضا علامة الأفعال كدولة مستقرة جينية5،،من67،8 . على الرغم من أن هيدروكسيميثيليشن الحمض النووي الغاية مرتبطة بالتعبير الجيني والشاذ تغييرات في الحمض النووي هيدروكسيميثيليشن المرتبطة ببعض الاضطرابات البشرية9،،من1011، العلاقات السببية بين تعديلات جينية في الحمض النووي، وتعمل غالباً ما تظل تحديا إنشاء، والتي يمكن أن تعزى جزئيا إلى عدم وجود أداة موثوقة لدقة إضافة أو إزالة التعديلات الدنا في الجينوم في تعريف الزماني والمكاني القرار.
هنا نحن تقرير استخدام epigenome الكيميائية إيندوسيبلي إعادة عرض أداة (عصير التفاح) للتغلب على العقبة التي تواجه دراسات عن العلاقات السببية بين النسخ هيدروكسيميثيليشن والجينات الحمض النووي. التصميم يستند إلى الافتراض بأن المجال الحفاز من TET2 (TET2CD) يمكن تقسيمها إلى اثنين الشظايا غير نشط عند المعرب عنها في خلايا الثدييات، ويمكن استعادة وظيفتها الانزيمية باتخاذ نهج ثنائي إيندوسيبلي كيميائيا ( الشكل 1A). لإنشاء نظام لتقسيم TET2CD، اخترنا ستة مواقع في TET2CD، تتألف من منطقة Cys غنية وإضعاف مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل β-اللولب (دسبه)، على أساس هيكل كريستال المبلغ عنها من مجمع TET2-الحمض النووي الذي يفتقر إلى منطقة تعقيد منخفض12. جينات اصطناعية ترميز ثنائي ربمسن إيندوسيبلي الوحدة النمطية FK506 ملزمة البروتين 12 (FKBP12) وفكبب ربمسن ملزمة المجال (FRB) الهدف الثدييات ربمسن14،15، جنبا إلى جنب مع ببتيد كليفينج الذاتي T2A وأدرج ببتيد تسلسل16،17، منفردة في مواقع مختارة انقسام داخل TET2CD. ويستند اختيار TET2 هدفنا الهندسة الاعتبارات التالية. كثيرا ما يلاحظ الطفرات الجسدية، والأولى في TET2 مع ما يصاحب ذلك انخفاض في هيدروكسيميثيليشن الحمض النووي في الاضطرابات البشرية بما في ذلك الاضطرابات النقوي والسرطان10، الذي يوفر معلومات مفيدة عن المواقع الحساسة التي ينبغي تجنبها الإدراج. ثانيا، جزء كبير من المجال TET2 الحفاز، لا سيما منطقة قليلة التعقيد، لا يمكن الاستغناء عنها للدالة الانزيمية12، مما يمكن لنا أن نصوغ سبليت-TET2 مصغر لتعديلات جينية إيندوسيبلي. بعد فرز أكثر من 15 بنيات، اختارت بناء معارضها استعادة نشاطها الأنزيمي ربمسن إيندوسيبلي أعلى في النظام الثدييات وعينت عصير التفاح18. نحن تصف هذه الوثيقة استخدام المعلمة متشيري عصير التفاح لتحقيق إيندوسيبلي الحمض النووي هيدروكسيميثيليشن ويعيد البناء جينية مع ربمسن، ويقدم ثلاثة أساليب للتحقق من إنتاج عصير التفاح بوساطة 5hmC في نظام الهاتف خلوي لنموذج HEK293T.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا أننا قد يتضح استخدام إنزيم TET2 انقسام هندسيا لتحقيق التحكم الزمني للحمض النووي هيدروكسيميثيليشن. عقب اكتشاف عائلة تيت ديوكسيجيناسي 5-ميثيسيتوسيني، تم إجراء العديد من الدراسات فك الوظائف البيولوجية تيت البروتينات وعلى المنتج الحافز الرئيسي 5hmC1،2،…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر المالية منح يدعم من “المعاهد الوطنية للصحة” (R01GM112003 إلى YZ)، مؤسسة ولش (BE-1913 إلى YZ) وجمعية السرطان الأمريكية (TBE RSG-16-215-01 إلى YZ)، والوقاية من السرطان ومعهد تكساس للبحث (RR140053 إلى YH، RP170660 إلى YZ)، جمعية القلب الأمريكية (16IRG27250155 إلى أي إتش)، والبرنامج جائزة جون س. دن مؤسسة البحوث التعاونية.
Materials
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Rapamycin | Sigma-Aldrich | 37094 | |
| Paraformaldehyde, 16% Solution | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | |
| Hydrochloric Acid | Amresco | 0369-500ML | |
| Albumin, Bovine | Amresco | 0332-100G | |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L | |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) | Active Motif | 39769 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) | Biotium | 40043 | |
| SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) | SHEL LAB | SVAC1E | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher Scientific | 15557036 | |
| Bio-Dot Apparatus | BIO-RAD | 1706545 | |
| Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 | Millipore | MABE146 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| West-Q Pico Dura ECL Solution | Gendepot | W3653-100 |
References
- Li, E., Zhang, Y. DNA methylation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133 (2014).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
- Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
- Spruijt, C. G., et al. Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives. Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).
- Lio, C. W., et al. Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility. eLife. 5, e18290 (2016).
- Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).
- Su, M., et al. 5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).
- Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).
- Huang, Y., Rao, A. Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer. Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).
- Lu, X., Zhao, B. S., He, C. TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases. Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).
- Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).
- Hashimoto, H., et al. Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA. Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).
- Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
- Clackson, T., et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).
- Ibrahimi, A., et al. Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences. Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6 (4), e18556 (2011).
- Lee, M., et al. Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling. J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).
- Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).
