En konstruerad Split-TET2 enzym för kemisk-inducerbara DNA Hydroxymethylation och epigenetiska Remodeling
Summary
Detaljerade protokoll för att införa ett bakåtkompilerade split-TET2 enzym (CiDER) i däggdjursceller för kemiska inducerbara DNA hydroxymethylation och epigenetiska remodeling presenteras.
Abstract
DNA-metylering är en stabil och ärftlig epigenetisk modifiering i däggdjur genomet och är involverad i reglering av genuttryck för att styra cellulära funktioner. Återföring av DNA metylering eller DNA demetylering, medieras av tio-elva translokation (TET) proteinfamiljen av dioxygenases. Även om det allmänt rapporterats att avvikande DNA-metylering och demetylering är associerade med defekter och cancer, hur dessa epigenetiska förändringar direkt bidra till den efterföljande förändringen i genen uttryck eller sjukdom progression oklar, till stor del på grund av bristen på tillförlitliga verktyg noggrant lägga eller ta bort ändringar av DNA i genomet definierade temporal och spatial upplösning. För att övervinna detta hinder, utformade vi en split-TET2 enzym att aktivera temporal kontroll av 5-metylcytosin (5mC) oxidation och efterföljande remodeling av epigenetiska staterna i däggdjursceller genom att lägga till kemikalier. Här, beskriver vi metoder för att introducera en kemisk-inducerbara epigenomet remodeling verktyg (CiDER), baserat på ett enzym som bakåtkompilerade split-TET2, i däggdjursceller och kvantifiera kemiska inducerbara produktionen av 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) med immunfärgning, flödescytometri eller en dot-blot-analys. Denna kemikalie-inducerbara epigenomet remodeling verktyg hittar brett bruk i förhör cellulära system utan att ändra den genetiska koden, liksom i sondera de epigenotype−phenotype förbindelserna i olika biologiska system.
Introduction
DNA-metylering, mestadels avser tillägg av en metylgrupp till cytosin kol 5 position att bilda 5-metylcytosin (5mC), är katalyseras av DNA metyl-transferaser (DNMTs). 5mC fungerar som en större epigenetiska mark i däggdjur genomet som ofta signalerar för transkriptionell repression, x-kromosom inaktivering och transposon ljuddämpning1. Återföring av DNA metylering medieras av familjen tio-elven translokation (TET) protein. TET enzymer tillhör järn (II) och 2-oxoglutarate beroende dioxygenases som katalyserar successiva oxidation av 5mC till 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) och 5-carboxycytosine (5caC). TET-medierad 5mC oxidation innebär ett extra lager av epigenetisk kontroll över däggdjur genomet. Upptäckten av TET har väckt intensiv intresse i fältet epigenetiska till avtäcka de biologiska funktionerna av TET proteiner och deras stora katalytisk produkt 5hmC. 5hmC är inte bara en intermediär under TET-medierad aktiv DNA demetylering2,3,4, men också fungerar som en stabil epigenetiska Markera5,6,7,8 . Även om DNA hydroxymethylation är starkt korrelerade med genuttryck och avvikande är förändringar i DNA hydroxymethylation förknippade med vissa mänskliga störningar9,10,11, orsakssambanden mellan epigenetiska förändringar på DNA och fenotyperna förblir ofta utmanande upprättas, som delvis kan hänföras till avsaknaden av tillförlitliga verktyg för att exakt lägga till eller ta bort DNA ändringar i genomet på definierade tidsmässiga och rumsliga upplösning.
Här rapporterar vi användningen av en kemikalie-inducerbara epigenomet remodeling verktyg (CiDER) att övervinna hindret inför studier av kausala relationer mellan DNA hydroxymethylation och gen transkription. Designen är baserad på antagandet att den katalytiska domänen av TET2 (TET2CD) kan delas in i två inaktiva fragment när uttryckt i däggdjursceller och dess enzymatiska funktion kan återställas genom en kemiskt inducerbara dimerization helhetssyn ( Figur 1A). För att upprätta ett split-TET2CD system, som vi valt ut sex platser i TET2CD, består av en Cys-rika region och ett dubbelsträngat β-helix (DSBH) veck, på grundval av en rapporterade kristallstruktur av TET2-DNA complex som saknar en låg komplexitet regionen12. En syntetisk gen som kodar för rapamycin-inducerbara dimerization modul FK506 bindande protein 12 (FKBP12) och FKBP rapamycin bindande domän (FRB) däggdjur målet på rapamycin14,15, tillsammans med en egen proteinspjälkande peptid T2A polypeptid sekvens16,17, infogades individuellt i de valda split-områdena inom TET2CD. Valet av TET2 till vårt tekniska mål bygger på följande överväganden. Första, somatiska mutationer i TET2 med samtidig minskning av DNA hydroxymethylation observeras ofta i mänskliga sjukdomar inklusive myeloiska sjukdomar och cancer10, som ger användbar information om känsliga platser bör undvikas för insättningspunkten. För det andra är en stor del av den TET2 katalytiska domänen, särskilt regionen låg komplexitet, dispensable för enzymatiska funktion12, vilket gör det möjligt för oss att farkoster en minimerad split-TET2 för inducerbara epigenetiska förändringar. Efter screening över 15 konstruktioner, var en konstruktion som uppvisade högsta rapamycin-inducerbara restaurering av dess enzymaktivitet i däggdjur systemet valt och som CiDER18. Vi beskriver häri användningen av mCherry-märkta CiDER att uppnå inducerbara DNA hydroxymethylation och epigenetiska remodeling med rapamycin, och presenterar tre metoder för att validera CiDER-medierad 5hmC produktion i cellulära modellsystem HEK293T.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här har vi illustrerat användningen av en konstruerad split-TET2 enzym att uppnå temporal kontroll av DNA hydroxymethylation. Efter upptäckten av TET familj av 5-methycytosine dioxygenas, många studier för att dechiffrera biologiska funktioner TET proteiner och deras stora katalytisk produkt 5hmC1,2,3, 4,5,6,</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar det finansiella stöd från National Institutes of Health bevilja (R01GM112003 till YZ), Stiftelsen Welch (BE-1913 till YZ), American Cancer Society (RSG-16-215-01 TBE till YZ), förebyggande av Cancer och Research Institute of Texas (RR140053 till YH, RP170660 till YZ), den American Heart associationen (16IRG27250155 till YH), och John S. Dunn stiftelse Collaborative Research Award Program.
Materials
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Rapamycin | Sigma-Aldrich | 37094 | |
| Paraformaldehyde, 16% Solution | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | |
| Hydrochloric Acid | Amresco | 0369-500ML | |
| Albumin, Bovine | Amresco | 0332-100G | |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L | |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) | Active Motif | 39769 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) | Biotium | 40043 | |
| SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) | SHEL LAB | SVAC1E | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher Scientific | 15557036 | |
| Bio-Dot Apparatus | BIO-RAD | 1706545 | |
| Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 | Millipore | MABE146 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| West-Q Pico Dura ECL Solution | Gendepot | W3653-100 |
References
- Li, E., Zhang, Y. DNA methylation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133 (2014).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
- Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
- Spruijt, C. G., et al. Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives. Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).
- Lio, C. W., et al. Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility. eLife. 5, e18290 (2016).
- Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).
- Su, M., et al. 5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).
- Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).
- Huang, Y., Rao, A. Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer. Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).
- Lu, X., Zhao, B. S., He, C. TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases. Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).
- Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).
- Hashimoto, H., et al. Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA. Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).
- Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
- Clackson, T., et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).
- Ibrahimi, A., et al. Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences. Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6 (4), e18556 (2011).
- Lee, M., et al. Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling. J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).
- Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).
