Undersøke flere, kan endogen post-translasjonell endringer for et mål protein være svært utfordrende. Teknikkene her utnytte en optimalisert lysis buffer og filter system utviklet med bestemte PTM målretting, affinitet matriser til å oppdage acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 og tyrosin fosforylering endringene for et mål protein med en enkelt, strømlinjeformet system.
Det er nå godt verdsatt at post-translasjonell endringer (PTMs) spiller en vesentlig rolle i å regulere et protein struktur og funksjon, som kan være avgjørende for et gitt protein rolle både fysiologisk og patologisk. Anriking av PTMs er ofte nødvendig når undersøke PTM statusen for et protein som mål, fordi PTMs er ofte midlertidig og relativt lav i overflod. Mange fallgruvene oppdages når berikende en PTM til en protein er målet, som buffer uforlikelighet, målet protein antistoffer er ikke IP-kompatible, tap av PTM signal og andre. Vanskelighetsgraden er forstørret når undersøke flere PTMs som acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 og tyrosin fosforylering for et gitt mål protein. Studere en kombinasjon av disse PTMs kan være nødvendig som crosstalk mellom PTMs er utbredt og kritisk protein regulering. Disse PTMs er ofte studerte i forskjellige lysis buffere og med unik hemmer komposisjoner. For å forenkle prosessen, et unikt denaturing lysis system ble utviklet som effektivt isolerer og beholder disse fire PTMs; dermed muliggjør undersøkelse av potensielle crosstalk i et enkelt lysis system. En unik filtersystem ble utviklet for å fjerne forurensende genomisk DNA fra lysate, som er et problematisk biprodukt av denaturing buffere. Robust affinitet matriser målretting hver av de fire PTMs ble utviklet sammen med bufferen systemet å maksimere berikelse og gjenkjenning av endogene tilstandene til disse fire PTMs. Denne omfattende PTM gjenkjenning verktøysett strømlinjeformer prosessen med å få viktig informasjon om hvorvidt et protein er endret av en eller flere av disse PTMs.
Post-translasjonell modifikasjoner (PTMs) er sterkt regulert endringer en protein, der endringen er lagt til eller fjernet på en bestemt måte. PTMs er ofte dynamisk, forbigående endringer som betydelig endre protein’s struktur, samhandlinger med partner proteiner, romlig lokalisering og til slutt aktivere protein utføre forskjellige funksjoner1,2 , 3 , 4. PTMs er så rikelig at de øker antall unike protein skjemaer (eller proteoforms) fra rundt 30.000 genet produkter til over en million proteoforms5,6. Identifisere PTMs og definere deres effekt på et mål protein er kritiske mot forståelse protein’s fysiologiske og patologiske funksjoner7,8,9,10, 11,12,13,14. Fungerer på Velg proteiner som tubulin, p53 og epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) har belyst PTMs15,16,17regulatoriske rollene. Disse studiene avdekket at regulering av disse proteinene skjer ved flere PTMs, og i mange tilfeller disse endringene jobber sammen for å fremme en bestemt funksjon. Nye studier har vist at både felles og negative PTM crosstalk kan oppstå på flere ulike proteiner18,19,20,21,22, 23,24,25. Men er PTM profiler til flertallet av proteiner bygget fra flere studier som har brukt ulike modeller og unike forholdene. Å ha en optimalisert system å undersøke flere PTMs i ett system ville være svært nyttig for å få innsikt i potensielle PTM crosstalk for et mål protein.
En utfordring med å undersøke PTMs i ett enkelt system er at spesifikke PTMs er undersøkt ved hjelp av forskjellige lysis buffere. For eksempel kan bruk av buffere som RIPA eller NP-40 som er brukt for fosforylering eller ubiquitination undersøkelsene være utilstrekkelig for å studere en labil PTM som små ubiquitin som modifikator (SUMO) ylation26. I tillegg ikke denaturing buffere er utilstrekkelig for dissociating protein interaksjoner, og kan føre til falsk positiv PTM identifikasjon27. Undersøker PTMs i en denaturing lyseringsbuffer kan bli foretrukket, som det er vesentlig bedre på å isolere proteiner fra alle mobilnettet rom28, vil distansere de fleste protein interaksjoner og vil hemme proteaser endre PTM stater, som deSUMOylases 26; men kan denaturing buffere kompromittere integriteten til spesifikk affinitet reagenser som ubiquitin bindende domene-basert verktøy27. Utvikle en denaturing-lignende lysis system å studere flere PTMs av et protein i en affinitet reagens-kompatibelt system ville være svært gunstig for PTM crosstalk undersøkelser.
Selv om denaturing buffere har hovedfordelene over ikke-denaturing buffere for å undersøke PTMs, de er færre vanligvis anvendt på grunn av sin betydelige ulemper, som inkompatibilitet med konvensjonelle protein analyser, betydelig genomisk deoksyribonukleinsyre (DNA) forurensning og avbrudd i immunoprecipitation (IP) reagenser29. Disse ulempene kan resultere i lengre Forberedelsestid og skader målet proteiner når klipping genomisk DNA. To vanlige metoder for å skråstille DNA omfatter sprøyte lyse og sonication29. Begge metodene krever omfattende optimalisering og ofte mangler presis reproduserbarhet. Alternative metoder for å fjerne genomisk DNA inkludere tillegg av DNAses; Dette kan imidlertid kreve ytterligere optimalisering og endringer i bufferen komposisjon. Til slutt ville en enkel og reproduserbar metode å fjerne genomisk DNA forurensning være gunstig når du arbeider med denaturing lysis buffere for PTM undersøkelser.
Målet med denne teknikken er å utvikle et system for å isolere og undersøke ubiquitination (Ub), fosforylering tyrosin (pY), SUMOylation 2/3 (SUMO 2/3) og acetylation (Ac) PTMs i ett enkelt system bedre undersøke PTM crosstalk for et mål protein. Denne PTM deteksjon system ble benyttet for å raskt undersøke endogene PTM profilen til flere mål proteiner i ett enkelt system. Ny innsikt i potensielle crosstalk var identifisert30,31. Samlet teknikken beskrevet her forbedrer eksisterende metoder for å undersøke PTMs og PTM crosstalk på tre forskjellige måter: 1) en unik denaturing buffer ble utviklet som isolerer proteiner fra alle mobilnettet avdelinger, samtidig som kompatibel med PTM affinitet reagenser, 2) en unik filtersystem ble utviklet som raskt fjerner genomisk DNA forurensning fra denaturert lysates med høy reproduserbarhet og krever ingen spesialisert utstyr og 3) robust affinitet perler, lyse system, og inhibitory reagenser er kompatible; dermed forenkle isolering av disse fire PTMs for et protein som mål å maksimere PTM berikelse, og effektivt undersøke mulige crosstalk.
Første tilnærminger til å bestemme om et mål protein er endret av en PTM utføres med målet protein spesifikke antistoffer for IP, etterfulgt av western blot med et PTM antistoff (f.eks., anti-acetyl lysin), eller ved å bruke et PTM antistoff for IP, fulgte ved western blot med de mål protein spesifikke antistoff30,31,33. Mens begge tilnærminger teoretisk arbeid, har utnytte en mål-protein-spesifikke antistoffer flere potensielle fallgruver, som antistoffer ikke IP kompatibel, eller store PTM modifikasjoner kan blokkere området antistoff anerkjennelse på målet protein34 ,35. Fordelen med PTM affinitet perlene er at antistoff eller bindende domenene spesifikt gjenkjenne PTM steder. dermed bør endringer målet protein ikke endre anerkjennelse av affinitet perler. Som et eksempel, PD-L1 Ub ble identifisert med teknikken beskrevet her, og både endogene mono – og poly-Ub ble observert (Figur 4). En fersk publikasjon av Lim et al. benyttet i vitro Ub teknikker for å undersøke PD-L1 Ub, og resultatet var svært lik resultatene som vises i Figur 436. Interessant, de har også utført IP med et PD-L1 antistoff å berike PD-L1 fra celle lysate, der Ub var overexpressed og MG-132 ble lagt til forbedre signalet. Ub mønsteret var ikke robust og svært forskjellig fra den i vitro Ub mønsteret. Undersøkelse av endogene PD-L1 Ub i celle kultur modeller ble ikke utført i Lim et al. rapporten til å klargjøre forskjellen mellom deres kultur og i vitro celledata.
Undersøker om et protein er endret av en PTM kan være utfordrende, p.g.a. lav overflod og forbigående Art37,38, og ofte krever berikelse gjennom IP. Effektiv IP av PTMs krever optimalisering av flere viktige trinn og reagenser, som lysis buffere og affinitet reagenser. Når undersøke flere PTMs av et mål protein, øker kreves sannsynlige optimalisering. Bruker blastR lysis systemet er et viktig skritt i denne protokollen, som den opprettholder robust IP evne, mens PTM oppdagelsen av pY, SUMO 2/3, Ub og Ac PTMs i ett enkelt system. Denne teknikken optimaliserer tid og ressursene som kreves for å avgjøre om et bestemt mål protein er endret av disse fire PTMs, og potensielt gir et bedre bilde av PTM crosstalk i forhold til sammenligning PTM resultatene utført ved hjelp av flere lysis systemer. Undersøkelse av blastR lyse systemets kompatibilitet med alternative PTMs, som glykosylering, ble utført; men har det ikke blitt undersøkt grundig for alle typer PTMs.
Store genomisk DNA kan forstyrre protein mål med enten kolorimetrisk nanodrop metoder, påvirke overføringen av proteiner i en SDS akrylamid gel og hindre protein og affinitet matrix interaksjon under IP analyser. Metoden beskrevet her benytter et spesialisert filter for å effektivt fjerne genomisk DNA forurensning, som er et viktig skritt i denne protokollen. For å markere dette punktet, viskositet testene ble utført før og etter blastR filter behandling, og resultatene viste en reduksjon fra en høy viskositet for viskositeten vann (data ikke vist). Denne endringen i viskositet ble støttet av resultatene i Figur 3viser nesten alle genomic DNA var fjernet. Viktigere, er DNA ikke skåret med denne metoden, som noen skåret DNA ikke vil bli fanget av filteret (data ikke vist). Dette verktøyet er bedre enn konvensjonelle metoder, som sonication eller sprøyte-DNA-klipping, fordi den krever ingen spesialisert utstyr, svært reproduserbare, og fjerner DNA i stedet for å klippe den. Videre, det vil ikke nedverdige protein i den lysate, som kan oppstå med konvensjonelle metoder29. Bruker filteret tar 5-30 sekunder per prøve sammenlignet med alternative metoder hvor effektiv sammenbrudd av DNA kan ta flere minutter (dvs., sprøyte klipping) og kan resultere i prøven heterogenitet som DNA forurensninger forblir i den lysate. Omfattende analyse av lysate pre- og post blastR filtreringen ble utført, og ingen observerbare forskjell i protein profilen ble observert av Coomassie, målet-spesifikke vest, eller total og mål-spesifikke PTM analyser; dermed integriteten til protein profilen ikke kan ha vært påvirket ved å filtrere ut genomisk DNA. Til slutt, dette filtersystemet er gunstig for western eller IP søknad der genomisk DNA finnes og kan påvirke tolkning av protein analyse.
Det er viktig å merke seg at det er potensial for false negativ oppdagelsen utnytte denne teknikken, som kan skyldes delvis til affinitet perle metning, bindende nettsted forstyrrelser eller PTM maskering. For eksempel kan en bestemt målenheten protein endres av Ac på svært lave nivåer; Dermed kan det ikke bli isolert av pan-acetyl lysin affinitet perler som blitt mettet av mer rikelig Ac-endret mål proteiner. Pågående studier utføres for å vurdere oppdagelsen grensene for affinitet reagensene benyttet i denne protokollen, men en nylig publikasjon antyder en svært robust oppdaging grense. Dataene viser at denne teknikken kan identifisere så lite som 17 acetylated målet protein molekyler per celle31. Likevel bestemte omstendigheter som cellen skriver spesifisitet, forbigående PTMs svar på bestemte stimuli, eller maskering av PTMs på grunn av protein samhandling kan alle føre til falske negative resultater. Dette er potensialet fallgrubene denne teknikken, som de fleste PTM IP-metodene. Derfor er det anbefalt å bekrefte resultatene ved hjelp av flere metoder.
Endringer som glykosylering og fosforylering har vist seg å konkurrere om lignende aminosyrer39,40, og andre PTMs som ubiquitination og fosforylering har vist å arbeide fortløpende for å regulere et protein funksjonen17,41. Siste arbeidet med neuropathological protein Tau understreket viktigheten av PTM crosstalk der Tau hyper-fosforylering og Tau SUMOylation forbedret hverandre42. Dessuten, denne gruppen viste at SUMOylation av Tau hindret poly-Ub og påfølgende Tau fornedrelse, muligens fører til aggregering. Dette er bare ett av mange eksempler på regulatoriske PTM crosstalk, og nytten av denne teknikken vil bidra til å belyse betydningen av PTMs og deres crosstalk i å regulere viktige proteiner i helse og sykdom.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Cytoskeleton Inc. forskere og Dr. Brian Hoover og Ashley Davis for deres kritisk gjennomgang, redigering og fruktbart diskusjoner på manuskriptet. I tillegg takker vi Dr. Robert Hom for hans bidrag under produksjonen av video manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Cytoskeleton Inc.
Cell lysis/genomic DNA removal and analysis | |||
1x phosphate buffered saline (PBS) | common buffer | Recipe: NaCl, KCl, Na2HPO4, KH2PO4 | |
BlastR lysis buffer | Cytoskeleton Inc. | BLST01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
Radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA) | common buffer | Recipe: Tris-HCl, NaCl, SDS, Sodium Deoxycholate, Igepal | |
Mammalian protein extraction reagent (mPER) | Thermofisher | 78503 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
Immunoprecipitation (IP) Lysis | Pierce | 87787 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
1% sodium dodecyl sulfate (SDS) denaturing buffer | common buffer | Recipe: PBS, SDS, EDTA, EGTA | |
Laemmli | common buffer | Recipe: Tris-HCl, SDS, glycerol, bromophenol blue | |
BlastR dilution buffer | Cytoskeleton Inc. | BDB01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
Protease Inhibitor Cocktail | Cytoskeleton Inc. | PIC02 | |
N-Ethylmaleimide (NEM) & N,N,N′,N′-Tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine (TPEN) | Cytoskeleton Inc. | NEM09BB | |
Trichostatin A (TSA) & Nicotinamide | Cytoskeleton Inc. | TSA01 | |
Activated Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Cytoskeleton Inc. | PYI01 | |
cell scrapers | Costar | 3008 | |
BlastR Filter | Cytoskeleton Inc. | BLR02 | |
BD Insulin syringe needle | BD | 08290-3284-11 | |
sonicator (Branson Sonifier) | Branson | Sonifier 450 | |
Precision Red Advanced Protein Reagent | Cytoskeleton Inc. | ADV02 | |
1 mL cuvettes | Fisher | 14955127 | |
Spectrophotometer (Genesys20) | Thermofisher | 4001 | Other spectrophotomers can be used to measure protein concentration |
Agarose | Fisher | BP1356-500 | |
1kb Deoxyribonucleic acid (DNA) ladder | NEB | N3232L | |
DNA gel box | Thermofisher | 7312 B1A | |
Tris/Borate/EDTA (TBE) buffer | common buffer | Recipe: Tris-HCl, Boric Acid, EDTA | |
PTM Immunoprecipitation | |||
Phosphotyrosine beads | Cytoskeleton Inc. | APY03-beads | |
Ubiquitination beads | Cytoskeleton Inc. | UBA01-beads | |
SUMOylation 2/3 beads | Cytoskeleton Inc. | ASM24-beads | |
Acetylation beads | Cytoskeleton Inc. | AAC04-beads | |
Phosphotyrosine control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG01-beads | |
Ubiquitination control beads | Cytoskeleton Inc. | CUB02-beads | |
SUMOylation 2/3 control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG01-beads | |
Acetylation control beads | Cytoskeleton Inc. | CIG02-beads | |
BlastR wash buffer | Cytoskeleton Inc. | BWB02 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
Bead elution buffer | Cytoskeleton Inc. | BEB01 | Proprietary mixture of detergents, salts, and other buffer additives |
microcentrifuge | Eppendorf | 5417 | Other microcentrifuges can be used |
tube rotator | ATR | RKVSD | Other end-over-end tube rotators can be used |
protein loading tips | VWR | 37001-150 | |
spin columns | Cytoskeleton Inc. | SPN22 | |
heat block 95 °C | Benchmark | BSH1002 | |
SDS-PAGE/Transfer/Western analysis | |||
5x sample buffer | common buffer | recipe: Bromophenol blue, dithiothreitol (DTT), Glycerol, SDS, Tris-HCl | |
novex wedge well 4-20% Tris-gly gels | Invitrogen | XP04200BOX | The large wedgewells are excellent for loading large volumes |
1x Running buffer | common buffer | recipe: Tris-HCl , Glycine, SDS | |
seeblue protein ladder | Life Technologies | LC5625 | |
electrophoresis cell | Invitrogen | Xcell surelock electrophoresis cell | Other electrophoresis cells can be used, however these are compatible the novex wedgewell gels |
power supply | Biorad | PowerPac HC | Other power supplies can be used |
1x Transfer buffer | common buffer | recipe: Tris-HCl, glycine, methanol | |
Transfer cell | Biorad | mini trans-blot cell | Other transfer cells can be used |
Immobilon- P membranes (PVDF) | millipore | IPVH 304F0 | |
non-fat milk | thrive | 813503015095 | |
Tris buffered saline with tween (TBST) | common buffer | recipe: Tris-HCl, NaCl, Tween 20 | |
Chemiluminescent Detection Reagent | Cytoskeleton Inc. | CLRA/CLRB | |
Cell growth and treatment | |||
Dulbecco's Modified Eagle's medium | ATCC | 30-2002 | |
Fetal bovine serum | ATLAS | F-0500-A | |
Epidermal growth factor | Cytoskeleton Inc. | CN02-A | |
150 mm cell culture plates | Corning | 430599 |