Genoom-brede RNAi Screening factoren te identificeren Host die moduleren van oncolytische Virus therapie

Summary

Hier beschrijven we een protocol voor de toepassing van high-throughput RNAi screening te ontdekken van de doelen van de gastheer die kunnen worden gemanipuleerd om het verbeteren van oncolytische virus therapie, specifiek rhabodvirus en vaccinia virus therapie, maar het kan gemakkelijk aangepast worden aan andere oncolytische virus platformen of voor het ontdekken van host-genen die virus replicatie in het algemeen moduleren.

Abstract

High-throughput genoom-brede RNAi (RNA-interferentie) screening technologie is wijd verbeid gebruikt om gastheer factoren die van invloed zijn virus replicatie te ontdekken. Hier presenteren we de toepassing van deze technologie op blootleggen host doelen die specifiek het moduleren van de replicatie van Maraba virus, een oncolytische rhabdovirus en vacciniavirus met als doel verbetering van de therapie. Terwijl het protocol is getest voor gebruik met oncolytische Maraba virus en oncolytische vacciniavirus, deze aanpak geldt voor andere oncolytische virussen en kan ook worden gebruikt voor de identificatie van de host-doelen die moduleren virus replicatie in zoogdiercellen in algemene. Dit protocol beschrijft de ontwikkeling en validatie van een assay voor high-throughput RNAi screening in zoogdiercellen, belangrijke overwegingen en voorbereiding maatregelen belangrijk zijn voor het uitvoeren van een primaire high-throughput RNAi scherm, en een stapsgewijze handleiding voor uitvoeren van een primaire high-throughput RNAi scherm; Bovendien is het in grote lijnen schetst voor de methoden voor de uitvoering van de secundaire scherm validatie en tertiaire validatieonderzoek. Het voordeel van high-throughput RNAi screening is dat het maakt het mogelijk een catalogus, in een uitgebreide en onbevooroordeelde manier, gastheer factoren die enig aspect van virus replicatie waarvoor een een in vitro assay zoals infectiviteit ontwikkelen kan, moduleren barsten grootte, en cytotoxiciteit. Het heeft de bevoegdheid om te ontdekken van biotherapeutic doelstellingen onvoorziene op basis van de huidige kennis.

Introduction

High-throughput genoom-brede RNAi screening is gebleken een instrument van onschatbare waarde voor het openbaren van biologische inzichten in diverse gebieden van studie, met inbegrip van virus biologie. In de afgelopen tien jaar of zo, talrijke groepen hebben zich ertoe verbonden cel-gebaseerde grootschalige RNAi screening om te identificeren uitgebreid host genen die virus replicatie (herzien in^1,2,,^{3,4 moduleren , 5 , 6 , 7}). interessa....

Protocol

1. ontwikkeling en validatie van een siRNA van de high-throughput screening test

Opmerking: Voor alle experimenten, groei Hepes-buffer media geschikt is voor elke cel-regel gebruiken. Zie afbeelding 1 voor een overzicht van de workflow van assay optimalisatie tot tertiaire validatie.

1. Vaststelling van de voorwaarden van de optimale transfectie
   1. Selecteer een tumor cellijn of een ideale meerdere tumor cellen lijnen waarmee het optimaliseren van de transfectie voorwaarden (bijvoorbeeld 786-O, NCI-H226, SF268, U373, OVCAR-8, U20S; Zie voor meer informatie over de selecti....

Results

Een overzicht van de workflow voor het identificeren van host doelstellingen ter verbetering van de oncolytische virus therapie wordt gepresenteerd in Figuur 1.

Zoals aangegeven in Figuur 1, is de kritieke eerste stap om het uitvoeren van een high-throughput RNAi scherm assay ontwikkeling. Figuur 2A biedt een monster plaat indeling voor de .......

Discussion

Hier presenteren we een protocol voor de toepassing van high-throughput RNAi screening te identificeren host doelen die kunnen worden gemanipuleerd om het verbeteren van oncolytische virus therapie. Dit is met succes getest met oncolytische Maraba virus en oncolytische vacciniavirus, maar, zoals opgemerkt, het kan worden aangepast voor gebruik met andere oncolytische virussen of andere virussen in het algemeen ter identificatie van de host-genen die virus replicatie moduleren. Het protocol van de screening is ook ontworp.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
siRNA library	GE Dharmacon	G-005005-02
Corning 384-well plate	Corning	3985
Falcon 384-well plate	Becton Dickinson	353962
Water	Sigma	W4502
siGenome SMARTpool PLK1	GE Dharmacon	M-003290-01
AllStars Negative Control siRNA	Qiagen	SI03650318
siGenome Non-targeting siRNA Pool #2	GE Dharmacon	D-001206-14-20
DMEM/HIGH Glucose	GE Healthcare Life Sciences	SH30022.01
Fetal Bovine Serum	Sigma	F15051-500ML
HEPES solution (1M)	Sigma	H3535-100ML
Penicillin-Streptomycin 100X solution	GE Healthcare Life Sciences	SV30010
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher Scientific	2500056
DPBS/Modified	GE Healthcare Life Sciences	SH30028.02
Lipofectamine RNAiMAX	Thermo Fisher Scientific	13778100
Oligofectamine	Thermo Fisher Scientific	1225011
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	22600-050
Resazurin sodium salt	Sigma	R7017-5G
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H21492
Formaldehyde (37% by weight)	Fisher Scientific	F79-4
500 ml bottles	Corning	430282
Adhesive Sealing Film For Microplates	Excel Scientific	361006007
Peelable Heat Sealing Foil	Thermo Fisher Scientific	AB-3720
BioTek MicroFlo Select Dispenser cassette	Fisher Scientific	11-120-625
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
MicroFlo Select (liquid dispenser)	Fisher Scientific	11120621
BioTek Synergy HT plate reader	Biotek	N/A
Opera Imaging and Analysis Instrument	PerkinElmer	HH10000115
KiNEDx Robotic Arm	Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics)	KX-300-660
Cytomat 24C Series Automated Incubator	Thermo Fisher Scientific	50080227
JANUS Automated Workstation	PerkinElmer	AJI4M01
Plate Carousel	Peak Analysis and Automation (formerly Peak Robotics)	N/A
Alps 3000 plate sealer	Thermo Fisher Scientific	AB-3000