Summary

Célula de ensayos de agregación para evaluar el atascamiento de la muesca de Drosophila con Trans-ligandos y su inhibición por Cis-ligandos

Published: January 02, 2018
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Summary

Complejidad de los sistemas en vivo hace que sea difícil distinguir entre la activación y la inhibición del receptor Notch por trans– y cis-ligandos, respectivamente. Aquí, presentamos un protocolo basado en los análisis agregación celular en vitro para la evaluación cualitativa y semicuantitativa de la Unión de la muesca de la Drosophila a trans-ligandos vs cis-ligandos.

Abstract

Señalización de Notch es un sistema de comunicación célula-célula evolutivamente conservado utilizado ampliamente en el desarrollo de animales y mantenimiento del adulto. Interacción del receptor Notch con ligandos de los vecinos células induce la activación de la vía de señalización (trans-activación), mientras que la interacción con ligandos de la misma célula inhibe la señalización (cis-inhibición). Equilibrio adecuado entre trans-activación y cis-inhibición ayuda a establecer niveles óptimos de señalización Notch en algunos contextos durante el desarrollo animal. Debido a los dominios de expresión superpuestos de la muesca y sus ligandos en muchos tipos celulares y la existencia de mecanismos de retroalimentación, estudiando los efectos de una determinada modificación poste-de translación en trans– y cis-interacciones de la muesca y sus ligandos en vivo es difícil. Aquí, describimos un protocolo para el uso de las células S2 de Drosophila en los ensayos de agregación celular para evaluar los efectos de derribar un modificador de la vía de Notch en la Unión de muesca a cada ligando trans y el cis. S2 las células transfectadas estable o transitorio con un vector de expresión de muesca se mezclan con las células que expresan cada ligando de Notch (serrado S2 o S2-Delta). Trans-unión entre los receptores y ligandos resulta en la formación de agregados celulares heterotípicos y se mide en términos del número de agregados por mL compuesto de > 6 células. Para examinar el efecto inhibitorio de cis-ligandos, S2 las células Co muesca y cada ligando se mezclan con las células Delta del S2 o S2-serrado y se cuantificó el número de agregados como se describió anteriormente. La disminución relativa del número de agregados debido a la presencia de cis-ligandos proporciona una medida de cis-ligand-mediada por la inhibición de la trans-vinculante. Estos ensayos sencillos pueden proporcionar datos semi cuantitativos sobre los efectos de manipulaciones genéticas o farmacológicas en la Unión de ranura a sus ligandos y pueden ayudar a descifrar los mecanismos moleculares subyacentes a los efectos en vivo de tales manipulaciones sobre la señalización de Notch.

Introduction

Canónica de la señalización de Notch es un mecanismo de comunicación de célula a célula de corto alcance que requiere contacto físico de los vecinos a las células para facilitar la interacción entre receptores Notch y sus ligandos1. Interacción del receptor Notch (presente en la superficie de las células receptores de señal) con ligandos (presentes en la superficie de envío de señal de las células) inicia la señalización de Notch y se conoce como trans-activación2. Por otro lado, la interacción entre muesca y sus ligandos en la célula misma conduce a la inhibición de la vía de Notch y es conocido como cis-inhibición de la3. El equilibrio entre trans– y cis-interacciones es necesaria para asegurar la óptima muesca dependiente de ligando señalización4. Drosophila tiene un receptor Notch y dos ligandos (Delta y serrado) a diferencia de los mamíferos, que tienen cuatro receptores Notch y cinco ligandos [jagged 1 (JAG1), JAG2, delta-like 1 (DLL1), DLL3 y DLL4]5. Esta simplicidad, el modelo de Drosophila ofrece la facilidad para diseccionar y estudio de los efectos de los modificadores vía las interacciones ligando de Notch y posteriormente sobre la señalización de Notch. En ciertos contextos durante el desarrollo animal (incluyendo desarrollo de ala de Drosophila), cis– y trans-interacciones participan para lograr la adecuada señalización Notch y células destino1,6 . Es importante distinguir los efectos de los modificadores de la vía de Notch en estos contextos en cis– y trans-las interacciones de la muesca con sus ligandos.

Nuestro grupo reportó anteriormente que además de un residuo de carbohidrato llamado xilosa a Drosophila muesca negativa regula la señalización de Notch en ciertos contextos, incluyendo ala desarrollo7. Pérdida de shams (la enzima que xylosylates muesca) conduce a un fenotipo de «pérdida de vena del ala»7. Más recientemente, experimentos de dosis génica y análisis clonal fueron utilizados para mostrar que pérdida de shams realza señalar muesca mediada por el Delta. Para distinguir si la señalización de Notch mejorada en shams mutantes es el resultado de la disminución de cis-inhibición o aumento de trans-activación, sobreexpresión ectópico estudios de ligandos de muesca en discos imaginal de ala de larvas se realizaron utilizando el controlador de la dpp-GAL4 . Estos experimentos proporcionan evidencias sugiriendo que Shams regula trans-activación de Notch por Delta sin afectar la muesca cis-inhibición por ligandos8. Sin embargo, retroalimentación normativa y efectos de los ligandos endógenos podrían complicar la interpretación de sobreexpresión ectópico estudios1,6,9.

Para resolver este problema, en células S2 de Drosophila 10 fueron utilizados, que preven un sistema simple en vitro ligando de Notch-interacción estudios11,12. Células S2 no expresar endógenos receptor de la muesca y Delta ligando11 y expresar un bajo nivel de Serrate13, que no afecta el ligando de Notch-agregación experimentos8. Por lo tanto, las células S2 pueden ser estable o transitorio transfected por muesca o ligandos individuales (Delta o serrado) para generar las células que expresan exclusivamente el receptor Notch o uno de sus ligandos o una combinación de ellos. Mezcla de células expresando muesca S2 con resultados de S2 ligand-expresar las células en la formación de agregados heterotípicos mediada por receptor-ligando vinculante11,12,14. Cuantificación de la formación agregada provee una medida de trans-vinculante entre la muesca y sus ligandos15 (figura 1). Del mismo modo, las células S2 pueden ser co transfected con muesca y Delta o serrado ligandos (por ejemplo, cis-ligandos). CIS-ligandos en estas células expresando muesca S2 derogar el atascamiento de la muesca con trans-ligandos y resultado en disminución de agregado formación8,12,14. La disminución relativa de formación agregada causada por cis-ligandos proporciona una medida del efecto inhibitorio de cis-ligandos de unión entre la muesca y trans-ligandos (figura 2). Por consiguiente, se utilizaron estudios de agregación de células para examinar el efecto de la pérdida de xylosylation de trans– y cis-interacciones entre la muesca y sus ligandos.

Aquí, presentamos un protocolo detallado para estudios de agregación de células para evaluar el atascamiento de la muesca con trans-ligandos y su inhibición por cis-ligandos utilizando células S2 de Drosophila . Por ejemplo, ofrecemos los datos que nos permitieron determinar el efecto de la muesca xylosylation de enlace entre la muesca y trans-Delta8. Estos ensayos sencillos proporcionan una evaluación semi-cuantitativa de las interacciones ligando-muesca en vitro y determinar los mecanismos moleculares subyacentes a los efectos en vivo de los modificadores de la vía de Notch.

Protocol

1. preparación de doble trenzado RNA (dsRNA) por caída de Shams Amplificación por PCR de los productos Utilice tipo salvaje blanco amarillo (w y) la DNA genomic y pAc5.1-EGFP como plantilla y las siguientes combinaciones de primer para amplificar los fragmentos de ADN utilizados en síntesis de dsRNA. Utilice el siguiente perfil térmico de PCR: desnaturalización (95 ° C, 30 s), recocido (58 ° C, 30 s) y extensión (72 º C, 1 min). …

Representative Results

Nuestras observaciones en vivo sugirieron que pérdida de la xylosyltransferase gene shams en el aumento de la señalización de Notch debido a aumentado mediada por Delta trans-activación de Notch sin afectar a la cis-inhibición de la Muesca por ligandos8. Para probar esta idea, fueron realizados en vitro estudios de agregación de células. En primer lugar, expresión de shams en células S2 fue derribado co…

Discussion

Canónica de la señalización de Notch depende de las interacciones entre el receptor Notch y sus ligandos5. Aunque la mayoría de los estudios sobre la vía de Notch considera principalmente la Unión de ranura y ligandos de células vecinas (trans), muesca y misma célula ligandos interactúan y estos llamados cis-interacciones pueden desempeñar un papel inhibitorio en la muesca señalización de3,4. Por consiguiente,…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores reconocen apoyo de NIH/NIGMS (R01GM084135 a HJN) y Fundación Mizutani Glycoscience (grant #110071 a HJN) y están agradecido a Tom V. Lee por discusiones y sugerencias sobre los ensayos y Spyros Artavanis-Tsakonas, Hugo Bellen, Robert Fleming, Ken Irvine y el Drosophila genómica recursos centro (DGRC) para líneas celulares y plásmidos.

Materials

BioWhittaker Schneider’s Drosophila medium, Modified Lonza 04-351Q
HyClone Penicillin-Streptomycin 100X solution GE Healthcare lifescience  SV30010
CELLSTAR 6 well plate Greiner Bio-One 657 160
CELLSTAR 24 well plate Greiner Bio-One 662160
VWR mini shaker Marshell Sceintific 12520-956
Hemocytometer Fisher Sceintific  267110
FuGENE HD Transfection Reagent Promega E2311
MEGAscrip T7 Transcription Kit Ambion AM1334
Quick-RNA MiniPrep (RNA purification Kit) Zymo Research R1054
VistaVision Inverted microscope VWR
9MP USB2.0 Microscope Digital Camera + Advanced Software AmScope MU-900 Image acquisition using ToupView software
PureLink Quick Gel Extraction Kit Invitrogen K210012
Fetal Bovine Serum GenDepot F0600-050
Methotrexate Sigma-Aldrich A6770-10
Hygromycin B Invitrogen HY068-L6
Copper sulphate Macron Fine Chemicals 4448-02
S2 cells Invitrogen R69007
S2-SerrateTom cells Gift from R. Fleming (Fleming et al, Development, 2013)
S2-Delta cells DGRC 152
S2-Notch cells DGRC 154
pMT-Delta vector DGRC 1021 Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pMT-Serrate vector Gift from Ken Irvine (Okajima et al, JBC, 2003)
pMT-Notch vector DGRC 1022 Gift from S. Artavanis-Tsakonas
pAc5.1-EGFP Gift from Hugo Bellen
TaqMan RNA-to-Ct 1-Step Kit Applied Biosystem 1611091
TaqMan Gene Expression Assay for CG9996 (Shams) Applied Biosystem Dm02144576_g1  with FAM-MGB dye
TaqMan Gene Expression Assay for CG7939 (RpL32) Applied Biosystem Dm02151827_g1 with FAM-MGB dye
Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system Applied Biosystem 4351405 96-well Block module

References

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Cite This Article
Pandey, A., Jafar-Nejad, H. Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands. J. Vis. Exp. (131), e56919, doi:10.3791/56919 (2018).

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