En preklinisk musmodell av osteosarkom att definiera den extracellulära vesikler-medierad kommunikationen mellan tumör och mesenkymala stamceller
Summary
Direktinsprutning av cancer-derived extracellulära blåsor (EVs) leder till omprogrammering av benmärg stödja tumör progression; Det är dock oklart vilka celler medla denna effekt. Häri, beskriver vi ett stegvisa protokoll för att undersöka EV-medierad tumör-mesenkymala stamceller (MSC) interaktioner i vivo, avslöjar en avgörande roll för EV-utbildade MSCs i metastaser.
Abstract
Inom den tumör mikromiljö bidra bosatta eller rekryterade mesenkymala stamceller (MSC) till malign progression i flera typer av cancer. Under påverkan av specifika Miljösignaler, kan dessa vuxna stamceller frigöra parakrin medlare leder till accelererad tumörtillväxt och metastasering. Definiera överhörning mellan tumör och MSCs är av primär betydelse att förstå mekanismerna bakom cancer progression och identifiera nya mål för terapeutisk intervention.
Cancerceller producerar höga mängder av extracellulära blåsor (EVs), som djupt kan påverka beteendet hos målceller i den tumör närmiljön eller på avlägsna platser. Tumör EVs bifoga funktionella biomolekyler, inklusive inflammatoriska RNAs och (onco) proteiner, som kan utbilda stromaceller att förbättra beteendet metastaserande cancer celler eller delta i förväg metastaserande nisch bildandet. I den här artikeln beskriver vi utvecklingen av en musmodell för prekliniska cancer som möjliggör specifik utvärdering av EV-medierad överhörning mellan tumör och mesenkymala stamceller. Först beskriver vi rening och karakterisering av tumör-utsöndras EVs och bedömning av EV internalisering av MSCs. Vi sedan göra användningen av en multiplex pärla-baserad immunoassay att utvärdera förändringen av MSC cytokin uttryck profilen framkallas genom cancer EVs. Slutligen vi illustrera generationen av en självlysande ortotop xenograft musmodell av osteosarkom som recapitulates tumör-MSC samspelet, och visar bidraget av EV-utbildade MSCs att tillväxt och metastas tumörbildning.
Vår modell ger möjlighet att definiera hur cancer EVs formar en tumör-stödjande miljö, och att utvärdera om blockad av EV-medierad kommunikation mellan tumör och MSCs förhindrar cancer progression.
Introduction
Den tumör närmiljön deltar aktivt i de flesta, om inte alla aspekter av uppkomst och cancer progression, inklusive metastaser bildandet och utvecklingen av resistens mot therapeutics1. Detta betonar prekliniska ortotop cancer musmodeller som tillåter dissektion av komplexa tumör-stroma interaktioner som inträffar i tumör nisch.
Bland de många cellulära komponenterna i den tumör mikromiljö bidra mesenkymala stamceller (MSC) starkt till cancer progression i flera cancerformer som bröstcancer, prostatacancer, hjärntumörer, multipelt myelom och osteosarkom2 ,3,4,5,6,7. MSCs är multipotenta stamceller som finns i olika vuxna och fostrets vävnader, inklusive benmärg, fettvävnad, moderkakan, navelsträngsblod och andra8,9. Svar på cancer-genererade inflammatoriska signaler, MSCs migrera mot tumören platser, införliva den tumör närmiljön och i slutändan differentieras till cancer-stödjande celler10. Dessa cancer-associerade MSCs tillhandahålla väsentliga faktorer (dvs, tillväxtfaktorer, chemokiner, cytokiner och immunsuppressiva medlare) för tumör progression agerar både i tumörceller och på omgivande stroma2, 3 , 11 , 12 , 13. medan tumör-främja effekterna av cancer-associerade MSCs har undersökts i flera cancer modeller, de mekanismer genom vilka tumörceller programmera MSCs att forma en cancer-främjande nisch är dåligt känd. Här beskriver vi generationen av en ortotop xenograft modell som uttryckligen tillåter studier av pro-tumörframkallande samspelet mellan ben cancerceller och MSCs via extracellulära blåsor (EVs).
EVs är avgörande medlare av kommunikationen mellan tumör och stromaceller14. EVs bär funktionella biomolekyler cellens ursprung, inklusive proteiner, lipider och reglerande RNAs. När släpptes extracellulära, dessa blåsor kan tas upp av omgivande celler eller bärs till avlägsna platser via blodet eller lymfatiska cirkulationen och djupt kan påverka målet cellen beteende. 15 , 16 , 17 exempelvis upptag av cancer EVs av stromal fibroblaster kan resultera i myofibroblast differentiering stödja angiogenes och accelererande tumör tillväxt i vivo18,19, internalisering av endotelceller celler kan stimulera tumör angiogenes och öka vaskulär permeabilitet16,20, och interaktion med immunceller kan leda till förtryck av den antitumöreffekt immunsvar21.
Vi har nyligen visat, med hjälp av en självlysande ortotop xenograft musmodell av osteosarkom, att tumörceller frigör stora mängder EVs som uppmanar MSCs att förvärva en pro-tumörframkallande och pro-metastaserad fenotyp. Denna effekt beror på en dramatisk förändring i MSC cytokin uttryck profilen (kallad ”MSC utbildning”), och kan förebyggas genom administrering av en terapeutisk interleukin-6-receptorn (IL-6R) antikropp7. Vårt arbete visat att cancer EVs avgörande modulatorer av MSC beteende, vilket ger en logik för närmiljön-riktade strategier för att stoppa osteosarkom progression. Häri, beskriver vi ett stegvisa protokoll för att undersöka den EV-medierad tumör-MSC interaktion i vivo. Denna modell syftar till att: 1) specifikt definiera cancer EV-inducerad förändringarna av MSC beteende i den tumör mikromiljö, 2) utvärdera hur detta samspel bidrar till ben tumörtillväxt och metastas-bildning, och 3) studie om stör av EV-medierad överhörning i vivo förhindrar cancer progression.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tumör-utsöndras extracellulära blåsor (EVs) kan ändra physiologyen av lokal och avlägsen mesenkymala celler att generera en tumör-stödjande miljö. Här beskriver vi generationen av en preklinisk musmodell av osteosarkom som gör dissekering av EV-medierade interaktioner mellan tumörceller och mesenkymala stamceller (MSC) i vivo. Vi visar att systemisk injektion av humana tumör EV-utbildade MSCs i möss med osteosarkom xenograft starkt främjar cancer tillväxt och metastas bildas genom att aktivera de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.R. Baglio stöddes av en gemenskap av Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) medfinansieras av Europeiska unionen. Detta projekt har dessutom fått finansiering från EU: s forskning och innovation-programmet Horisont 2020 enligt Marie Sklodowska-Curie bidragsavtalet ingen 660200 (att S.R. Baglio).
Materials
| Equipment | |||||||
| Ultra Centrifuge | Beckman | Optima L-90K | |||||
| Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor | ||||
| Transmission electron microscope | Zeiss | EM109 | Or similar TEM | ||||
| Digital camera | Nikon | DMX 1200F | Or similar camera | ||||
| Imaging software TEM | Nikon | ACT-1 | |||||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Imager.D2 | Or similar Fluorescence microscope | ||||
| Imaging software FM | Zeiss | ZEN Blue | |||||
| Incubator | Nuaire | 4750E | |||||
| Centrifuge | Hettick | ROTANTA 460R | |||||
| -80 Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |||||
| FACS | BD | BD FACScalibur | Or similar flow cytometer | ||||
| Drill | Ferm | FCT-300 | With 0.8 mm drill | ||||
| HSS micro twist drills, 0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm drill | ||||
| IVIS camera | Xenogen | Ivis Lumina | Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
| Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
| 10 µL Syringe | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |||||
| Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm | Hamilton | n.a. | |||||
| Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |||||
| Autoclave | Astell | n.a. | |||||
| Heat Lamp | Philips | n.a. | |||||
| Culture media | |||||||
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | RYG35912 | |||||
| Platelet Lysate | n.a. | n.a. | |||||
| IMDM medium | Lonza | BE12-722F | |||||
| alpha-MEM medium | Lonza | BE02-002F | |||||
| DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |||||
| pen/strep/glutamine | GIBCO | 10378-016 | |||||
| heparin | LEO | 012866-08 | |||||
| Trypsin/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |||||
| Cells | |||||||
| adipose deriverd MSCs | n.a. | n.a. | |||||
| GFP-positive MSCs | n.a. | n.a. | |||||
| human fibroblasts | n.a. | n.a. | |||||
| 143B cells | ATCC | CRL-8303 | |||||
| FLUC-143B cells | ATCC | CRL-8303 | Transduced | ||||
| Disposables | |||||||
| Culture flasks 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |||||
| 50 mL tubes | Greiner bio-one | 210261 | |||||
| Freeze tubes | Thermoscientific | 377224 | |||||
| Ultra-Clear tubes | Beckman | 344058 | Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes | ||||
| 0,22 µm filter | Millex | SLGV033RS | |||||
| 200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids | EMS (Electron Microscopy Sciences) | ||||||
| 0.5 mL insulin syringes with 29G Needle | Terumo | U-100 | |||||
| Petri dish | Sigma – Aldrich | P7612 | |||||
| Filter paper | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |||||
| Reagents / kits | |||||||
| paraformaldehyde | Alfa Aeser | 43368.9M | |||||
| PBS | Braun | 220/12257974/110 | |||||
| glutaraldehyde | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 16300 | |||||
| uranyl oxalate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22510 | |||||
| urany acetate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22400 | |||||
| methyl cellulose | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 1560 | |||||
| PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referred to in the manuscript as GFLD | ||||
| BSA | Sigma | A8412 | |||||
| CBA – human inflammatory cytokine kit | BD | 551811 | |||||
| Formaldehyde 37% | VWR | 104003100 | |||||
| Carbon Steel surgical blades | Swann-Morton | 206 | Referred to in the manuscript as surgical knife | ||||
| anti-human vimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Clone V9 | ||||
| Antibody diluent | DAKO | S0809 | |||||
| HRP-labeled anti mouse IgG antibody | Life Technologies | 32230 | |||||
| DAB-kit | DAKO | K500711 | |||||
| hematoxyllin | Sigma | GHS232 | |||||
| EDTA-buffer | n.a. | n.a. | |||||
| Citrate buffer | n.a. | n.a. | |||||
| rabbit polyclonal anti-GFP antibody | Abcam | n.a. | Ab290 | ||||
| DAPI | Life Technologies | D1306 | |||||
| Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup | Bayer | n.a. | Sinaspril, paracetamol solution for kids | ||||
| Isoflurane 1000 mg/g | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
| buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | n.a. | |||||
| lidocaine-HCL 2% | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
| 70% ethanol | VWR | 93003.1006 | |||||
| Tissue glue | Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate | Vygon | LB604060 | ||||
| Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a. | |||||
| D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |||||
| Glass slides | Thermo scientific | 630-0954 | |||||
| Stainless steel loops | n.a. | n.a. | |||||
| Mice experiments | |||||||
| Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA | ENVIGO | n.a. | |||||
| Paper-pulp smart home (cage enrichment) | Bio Services | n.a. | |||||
| Alpha-dri bedding material | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |||||
| Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |||||
| Sutures | Ethicon | V926H | |||||
| Scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (or similar) | ||||
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (or similar) | ||||
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Karnoub, A. E., et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature. 449 (7162), 557-563 (2007).
- Jung, Y., et al. Recruitment of mesenchymal stem cells into prostate tumours promotes metastasis. Nat Commun. 4, 1795 (2013).
- Shahar, T., et al. Percentage of mesenchymal stem cells in high-grade glioma tumor samples correlates with patient survival. Neuro Oncol. 19 (5), (2016).
- Behnan, J., et al. Recruited brain tumor-derived mesenchymal stem cells contribute to brain tumor progression. Stem Cells. 32 (5), 1110-1123 (2014).
- Giallongo, C., et al. Granulocyte-like myeloid derived suppressor cells (G-MDSC) are increased in multiple myeloma and are driven by dysfunctional mesenchymal stem cells (MSC). Oncotarget. 7 (52), 85764-85775 (2016).
- Baglio, S. R., et al. Blocking tumor-educated MSC paracrine activity halts osteosarcoma progression. Clin Cancer Res. 23 (14), 3721-3733 (2017).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Shi, Y., Du, L., Lin, L., Wang, Y. Tumour-associated mesenchymal stem/stromal cells: emerging therapeutic targets. Nat Rev Drug Discov. 16 (1), 35-52 (2017).
- Ridge, S. M., Sullivan, F. J., Glynn, S. A. Mesenchymal stem cells: key players in cancer progression. Mol Cancer. 16 (1), 31 (2017).
- Luo, J., et al. Infiltrating bone marrow mesenchymal stem cells increase prostate cancer stem cell population and metastatic ability via secreting cytokines to suppress androgen receptor signaling. Oncogene. 33 (21), 2768-2778 (2013).
- Huang, W. -. H., Chang, M. -. C., Tsai, K. -. S., Hung, M. -. C., Chen, H. -. L., Hung, S. -. C. Mesenchymal stem cells promote growth and angiogenesis of tumors in mice. Oncogene. 32 (37), 4343-4354 (2013).
- Patel, S. A., Meyer, J. R., Greco, S. J., Corcoran, K. E., Bryan, M., Rameshwar, P. Mesenchymal stem cells protect breast cancer cells through regulatory T cells: role of mesenchymal stem cell-derived TGF-beta. J Immunol. 184 (10), 5885-5894 (2010).
- Becker, A., Thakur, B. K., Weiss, J. M., Kim, H. S., Peinado, H., Lyden, D. Extracellular vesicles in cancer: Cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and protein that promote tumor growth and provide diagnostic biomarkers. Nat Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat Med. 18 (6), 883-891 (2012).
- Zomer, A., et al. In vivo imaging reveals extracellular vesicle-mediated phenocopying of metastatic behavior. Cell. 161 (5), 1046-1057 (2015).
- Webber, J., Steadman, R., Mason, M. D., Tabi, Z., Clayton, A. Cancer exosomes trigger fibroblast to myofibroblast differentiation. Cancer Res. 70 (23), 9621-9630 (2010).
- Webber, J. P., et al. Differentiation of tumour-promoting stromal myofibroblasts by cancer exosomes. Oncogene. 34 (3), 290-302 (2015).
- Zhou, W., et al. Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis. Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).
- Whiteside, T., Anastasopoulou, E., Voutsas, I., Papamichail, M., Perez, S., Nunes, D. Exosomes and tumor-mediated immune suppression. Expert Rev Mol Diagn. 15 (10), 1293-1310 (2016).
- Verweij, F. J., Van Eijndhoven, M. A. J., Middeldorp, J., Pegtel, D. M. Analysis of viral microRNA exchange via exosomes in vitro and in vivo. Methods Mol Biol. 1024, 53-68 (2013).
- Baglio, S. R., et al. Human bone marrow- and adipose-mesenchymal stem cells secrete exosomes enriched in distinctive miRNA and tRNA species. Stem Cell Res Ther. 6 (1), 127 (2015).
- Naaijkens, B. A., et al. Human platelet lysate as a fetal bovine serum substitute improves human adipose-derived stromal cell culture for future cardiac repair applications. Cell Tissue Res. 348 (1), 119-130 (2012).
- Grisendi, G., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells as stable source of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand delivery for cancer therapy. Cancer Res. 70 (9), 3718-3729 (2010).
- Cosette, J., Abdelwahed, R. B., Donnou-Triffault, S., Sautès-Fridman, C., Flaud, P., Fisson, S. Bioluminescence-based tumor quantification method for monitoring tumor progression and treatment effects in mouse lymphoma models. J Vis Exp. (113), (2016).
- Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
- Hoshino, A., et al. Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis. Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).
- Clayton, A., Mitchell, J. P., Court, J., Mason, M. D., Tabi, Z. Human tumor-derived exosomes selectively impair lymphocyte responses to interleukin-2. Cancer Res. 67 (15), 7458-7466 (2007).
- Wieckowski, E. U., Visus, C., Szajnik, M., Szczepanski, M. J., Storkus, W. J., Whiteside, T. L. Tumor-derived microvesicles promote regulatory t cell expansion and induce apoptosis in tumor-reactive activated cd8+ T lymphocytes. J Immunol. 183 (6), 3720-3730 (2009).
- Valenti, R., Huber, V., Iero, M., Filipazzi, P., Parmiani, G., Rivoltini, L. Tumor-released microvesicles as vehicles of immunosuppression. Cancer Res. 67 (7), 2912-2915 (2007).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
- Lin, L. Y., et al. Tumour cell-derived exosomes endow mesenchymal stromal cells with tumour-promotion capabilities. Oncogene. 35 (46), 6038-6042 (2016).
