आनंद, lignification गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक दोहरी लेबलिंग प्रोटोकॉल विकसित किया गया था । सिंथेटिक monolignol पत्रकारों और SPAAC और CuAAC bioorthogonal क्लिक करें प्रतिक्रियाओं का एक अनुक्रमिक संयोजन का उपयोग करना, इस पद्धति के लिए कारक है कि lignins मेंplanta की उत्पत्ति को विनियमित के गहराई से विश्लेषण करने के लिए मार्ग प्रशस्त ।
लिग्निन ग्रह और lignocellulosic बायोमास का एक प्रमुख घटक पर सबसे प्रचलित के एक पॉलिमर है । इस phenolic बहुलक विकास और उच्च पौधों के जीवन में एक महत्वपूर्ण संरचनात्मक और सुरक्षात्मक भूमिका निभाता है । हालांकि जटिल vivo में lignification प्रक्रियाओं को विनियमित तंत्र दृढ़ता से कई संयंत्र व्युत्पंन उत्पादों के औद्योगिक valorization प्रभाव, वैज्ञानिक समुदाय अभी भी एक लंबा रास्ता तय करने के लिए उंहें समझने जाना है । एक साधारण तीन कदम कार्यप्रवाह में, दोहरी लेबलिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत इस के साथ साथ संयंत्र के ऊतकों के सक्रिय रूप से lignifying क्षेत्रों के लिए सक्षम बनाता है । पहला कदम दो स्वतंत्र रासायनिक पत्रकारों, दो देशी monolignols कि लिग्निन एच और जी इकाइयों को जंम देने के किराए के चयापचय निगमन में होते हैं । लिग्निन पॉलिमर बढ़ती में शामिल करने के बाद, प्रत्येक रिपोर्टर तो विशेष रूप से bioorthogonal SPAAC/CuAAC क्लिक प्रतिक्रियाओं के एक अनुक्रमिक संयोजन के माध्यम से अपनी फ्लोरोसेंट जांच के साथ लेबल है । लिग्निन autofluorescence के साथ संयुक्त, इस दृष्टिकोण तीन की पीढ़ी की ओर जाता है-रंग संयंत्र सेल दीवारों के भीतर लिग्निन के स्थानीयकरण के नक्शे फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा और उपस्थिति या अनुपस्थिति पर सटीक स्थानिक जानकारी प्रदान करता है सक्रिय संयंत्र के ऊतकों, कोशिकाओं और अलग सेल दीवार परतों के पैमाने पर lignification मशीनरी ।
पिछले दो दशकों में, रासायनिक रिपोर्टर रणनीति के रूप में एक शक्तिशाली दो कदम पद्धति के रूप में उभरा है गैर आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग जैव अणुओं की गतिशीलता और कार्यों की जांच । 1 , 2 , 3 इस रणनीति में एक छोटे मॉडुलन के साथ ब्याज की जैव अणु के एक सिंथेटिक एनालॉग- केमिकल रिपोर्ट र-पहले जीवित जीव द्वारा metabolized है, और फिर एक रासायनिक जांच (जैसे, प्रतिदीप्ति के लिए एक fluorophore फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग) covalently bioorthogonal क्लिक रसायन विज्ञान के माध्यम से शामिल रिपोर्टर से जुड़ा हुआ है । जांच तेजी से और विशेष रूप से शुरू की रासायनिक संशोधन के साथ प्रतिक्रिया करना चाहिए, जबकि रहने वाले सिस्टम में मौजूद किसी भी जैव अणुओं को निष्क्रिय किया जा रहा है । कई मायनों में, इस विधि अत्यधिक विशिष्ट क्लिक रसायन विज्ञान के उपयोग के माध्यम से आम bioconjugation तकनीकों की सीमाओं पर काबू पा ligations जिससे चयापचयों या biomacromolecules कि पहले से दुर्गम थे ट्रैक करने का अवसर प्रदान लिविंग सिस्टम में4,5,6.
जीवाणु और पशु कोशिकाओं में इस शक्तिशाली विधि की तेजी से बढ़ती लोकप्रियता के बावजूद, संयंत्र जीव विज्ञान में इसके उपयोग का वर्णन रिपोर्ट आश्चर्यजनक रूप से कुछ और दूर के बीच7,8,9,10, 11,12. हम विशेष रूप से पौधों में इस रणनीति को लागू करने में रुचि रखते थे लिग्निन के गठन का अध्ययन, एक ग्रह पर सबसे प्रचलित और बायोमास के एक प्रमुख घटक के lignocellulosic । 13 , 14 लिग्निन एक phenolic बहुलक है कि विकास और उच्च पौधों के जीवन में एक महत्वपूर्ण संरचनात्मक और सुरक्षात्मक भूमिका निभाता है ।
यह आम तौर पर तीन 4-hydroxyphenylpropanoid moieties: एच (पी-hydroxyphenyl), जी (guaiacyl) और एस (syringyl) इकाइयों से क्रमशः तीन ‘ monolignols ‘ (पी-coumaryl, coniferyl और sinapyl अल्कोहल) से प्राप्त की जाती है जो कोशिका के कोशिका में phenylpropanoid मार्ग के माध्यम से संश्लेषित (चित्रा 1). सेल दीवार को निर्यात किया जा रहा है के बाद, monolignols peroxidases या laccases के बाद जो वे विशुद्ध रूप से रासायनिक कट्टरपंथी युग्मन प्रतिक्रियाओं से गुजरना करने के लिए polymerize लिग्निन पॉलिमर, एक प्रक्रिया lignification द्वारा कण के लिए ऑक्सीकरण हो जाता है । 15 , 16 हालांकि lignins दृढ़ता से कई संयंत्र-व्युत्पंन उत्पादों के औद्योगिक valorization प्रभाव, वैज्ञानिक समुदाय अभी भी एक लंबा रास्ता तय करने के लिए जटिल lignification विनियमन तंत्र को समझने की है ।
चित्रा 1: संयंत्र कोशिकाओं में lignification प्रक्रिया. Monolignols cytosol में फेनिलएलनिन से विश्लेषित होते हैं. सेल दीवार को निर्यात किया जा रहा है के बाद, monolignols peroxidases या laccases के बाद जो वे विशुद्ध रूप से रासायनिक कट्टरपंथी युग्मन प्रतिक्रियाओं से गुजरना करने के लिए polymerize लिग्निन पॉलिमर, एक प्रक्रिया lignification द्वारा कण के लिए ऑक्सीकरण हो जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
हालांकि glycan विश्लेषण के लिए bioorthogonal प्रतिक्रियाओं के उपयोग पर रिपोर्टों के कई हैं,2,3,17 उनके अंय प्रकार के अणुओं के लिए आवेदन उदाहरण कम कर रहे हैं । लिग्निन इमेजिंग प्रयोजनों के लिए bioorthogonal रसायन विज्ञान का उपयोग हाल ही में Tobimatsu एट अल द्वारा अग्रणी था । 8 Arabidopsis थालियाना में लिग्निन बहुलक में coniferyl शराब किराए के शामिल करने के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए जहां यह जी इकाइयों,8रूपों,9 इस प्रकार की अवधारणा का सबूत है कि प्रदर्शन इस संदर्भ में केमिकल रिपोर्टर रणनीतियाँ लागू होती हैं. CuAAC का उपयोग भी एक अलग coniferyl शराब व्युत्पंन का उपयोग कर एक कुछ महीने बाद Bukowski एट अलद्वारा सचित्र था । 9 तथापि, लिग्निन भी एच और एस इकाइयों और lignification प्रक्रिया की एक गहरी समझ शामिल है कैसे monolignols के सभी बहुलक में शामिल कर रहे है और क्या कारकों अपनी संरचना को नियंत्रित कर सकते है के बारे में अधिक ज्ञान की आवश्यकता है । इस क्षेत्र में नई अग्रिम वर्तमान में रहने वाले सिस्टम में एक साथ कई रासायनिक पत्रकारों को ट्रैक करने के लिए कुशल तरीके के विकास पर निर्भर करते हैं । हालांकि glycans पर कुछ लेख हाल के वर्षों में नींव रखी है18,19,20,21,22, दोहरी लेबलिंग दृष्टिकोण में एक बड़ी चुनौती रह bioorthogonal केमिस्ट्री. यदि एक प्रतिलिपि एकल लेबलिंग क्लिक करें प्रोटोकॉल को विकसित करने के लिए कठिन है, तो दोहरी लेबलिंग दृष्टिकोण है कि दो अलग रासायनिक पत्रकारों पर पारस्परिक रूप से संगत bioorthogonal प्रतिक्रियाओं के मिलकर में अनुकूलन की आवश्यकता है और भी कठिन है । कुछ उदाहरण है कि इस पहलू का बीड़ा उठाया तनाव का एक संयोजन-पदोंनत azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) और alkene-tetrazine व्युत्क्रम इलेक्ट्रॉनिक मांग Diels-Alder (DAinv) के लिए पशु कोशिकाओं में glycans का अध्ययन प्रतिक्रियाओं का इस्तेमाल किया । हालांकि, हमने सोचा था कि DAinv प्रतिक्रिया के bioorthogonality लिग्निन की संरचनात्मक सुविधाओं के कारण इस अनुप्रयोग में गारंटी नहीं हो सकता है (जो इलेक्ट्रॉन अमीर प्रतिस्थापित cinnamyl-प्रकार मोनोमर कि इलेक्ट्रॉन के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं-गरीब dienes जैसे tetrazine जांच DAinv प्रतिक्रियाओं में उपयोग किया जाता है) और यह गैर-विशिष्ट लेबलिंग उत्पन्न कर सकता है । इसके अलावा, दाinv प्रतिक्रिया रासायनिक संभालती है कि कृत्रिम रूप से उपयोग करने के लिए मुश्किल है की आवश्यकता है, साथ ही भारी और lipophilic जा रहा है जिससे संभावना है कि शामिल करने की दर, परिवहन और/ रिपोर्टर वीवो में प्रभावित हो सकता है । जैसा कि हमने माना है कि बाद पहलू lignification अध्ययन के लिए एक क्लिक रसायन विज्ञान दृष्टिकोण के मामले में विशेष रूप से प्रासंगिक था, हम एक अलग दिशा चुना और एक Bioorthogonal बंधाव इमेजिंग अनुक्रमिक रणनीति (आनंद) का विकास एक का उपयोग vivo में तनाव-संवर्धित Azide-Alkyne Cycloaddition (SPAAC) और कॉपर उत्प्रेरक Azide-Alkyne Cycloaddition (CuAAC) का संयोजन । 23
इन दो प्रतिक्रियाओं वास्तव में दो मुख्य bioorthogonal क्लिक करें प्रतिक्रियाओं कि तारीख करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और अधिक विशेष रूप से लिग्निन इमेजिंग के कुछ उदाहरण है कि हाल ही में प्रकाशित किए गए थे में हैं । 8 , 9 हमारे दोहरी लेबलिंग रणनीति एक monolignol रिपोर्टर और दूसरे पर एक टर्मिनल alkyne पर एक azide moiety के उपयोग में सक्षम बनाता है, दो रासायनिक संभालती है कि मैं कर रहे हैं) जैविक रूप से प्रासंगिक संरचनाओं और द्वितीय के प्रति प्रतिक्रिया) आकार में बहुत छोटा (चित्रा 2 ). एक परिणाम के रूप में, इन सिंथेटिक संशोधनों के अध्ययन के तहत भौतिक के गुणों पर इस प्रकार के प्रभाव को कम करने और परिवहन के मामले में अप्राकृतिक और प्राकृतिक monolignol सब्सट्रेट के बीच संभव विसंगतियों को कम करने है चयापचय निगमन कदम के दौरान metabolization दरों । हालांकि SPAAC और CuAAC के संयोजन पहली नज़र में बहुत सहज ज्ञान युक्त लगता है, यह हमारे ज्ञान के लिए केवल इस रणनीति और glycans के अलावा अंय संरचनाओं पर पहली आवेदन का उपयोग दोहरी अंकन का दूसरा उदाहरण है । 12 , 23
चित्रा 2: आनंद दोहरी लेबलिंग रणनीति । रासायनिक पत्रकारों एचAZ और जीALK देशी एच और जी monolignols के अनुरूप टैग कर रहे हैं । वे पहले exogenous खिला (चरण 1) द्वारा सेल दीवारों के बढ़ते लिग्निन पॉलिमर में शामिल कर रहे हैं । Cyclooctyne-और azide कार्यात्मक फ्लोरोसेंट जांच कर रहे है तो क्रमिक रूप से bioorthogonal क्लिक करें रसायन विज्ञान द्वारा शामिल पत्रकारों को ligated: SPAAC प्रतिक्रिया (चरण 2) HAZ इकाइयों के अत्यधिक विशिष्ट है और एक CuAAC प्रतिक्रिया के बाद ( चरण 3) कि जीALK इकाइयों (चरण 3) के विशिष्ट है, इस प्रकार दोनों पत्रकारों के विशिष्ट स्थानीयकरण की अनुमति एक ही नमूने में स्वतंत्र रूप से । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
हम सबसे पहले डिजाइन और azide-टैग monolignol रिपोर्टर hAZ ( पीके किराए-coumaryl शराब और लिग्निन एच इकाइयों के अग्रदूत साबित), और फिर आनंद दोहरी लेबलिंग रणनीति है जिसमें यह मिलकर में प्रयोग किया जाता है ईजाद पहले alkyne की सूचना दी-टैग की गईं जीALK,9 (coniferyl शराब के किराए और लिग्निन जी इकाइयों के अग्रदूत) । इस प्रतिलिपि प्रोटोकॉल में विकसित और सन में परीक्षण किया, एक आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण प्रजातियों के पौधे, एचAZ और जीALK के दोहरी चयापचय निगमन में लिग्निन पहली अनुक्रमिक SPAAC से पहले प्राप्त की है/CuAAC लेबलिंग. यहां, टैग की गईं एचAZ इकाइयों पहले विशेष रूप से एक cyclooctyne-कार्यात्मक fluorophore के SPAAC बंधाव के माध्यम से लेबल कर रहे हैं, CuAAC के बाद, टैग जीपर एक दूसरे फ्लोरोसेंट जांच की मध्यस्थता बंधावALK इकाइयां हैं । इस विधि संयंत्र सेल दीवारों के भीतर lignification प्रक्रियाओं की गतिशीलता की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया और पार वर्गों स्टेम करने के लिए vivo में लागू किया जा सकता है, रहने के साथ ही विभिन्न प्रजातियों के पौधों के अंकुरों.
जैसा कि पहले उल्लेख किया है, इस पत्र में प्रस्तुत दोहरी लेबलिंग आनंद प्रोटोकॉल vivo12,23 मेंएक SPAAC/CuAAC संयोजन के पहले उदाहरणों में से एक है । हर कदम को अच्छी तरह से अनुकूलित और मान्य किया गया था, और यह बहुत महत्वपूर्ण है कि क्रम में दो क्लिक रसायन शास्त्र लेबलिंग प्रतिक्रियाओं क्रमिक रूप से प्रदर्शन कर रहे हैं का सम्मान किया जाता है (यानी, SPAAC पहले, CuAAC द्वारा पीछा). सभी पार नियंत्रण से पता चला कि प्रत्येक लेबलिंग कदम विशिष्ट है जब आनंद प्रोटोकॉल23 लागू किया जाता है: बाहर ले SPAAC कदम पहले एचAZ azide कार्यों के उच्च chemoselective लेबल की ओर जाता है द्वारा cyclooctyne-कार्यात्मक fluorophore के माध्यम से एक [3 + 2] तेजी से कैनेटीक्स के साथ cycloaddition प्रतिक्रिया । एक बार एचAZ इकाइयों टैग कर रहे हैं, CuAAC कदम महसूस तांबा (I) catalyzed सक्रियण जीALK टर्मिनल alkynes के triazole-azide ५४५ जांच के साथ प्रतिक्रिया द्वारा fluor लिंक उत्पंन करने के लिए बाहर किया जा सकता है । इसके विपरीत, रिवर्स आदेश (यानी, CuAAC पहले, SPAAC द्वारा पीछा किया) के रूप में यह जीALK और एचAZ इकाई पार-युग्मन, जो fluorophore बंधाव के साथ प्रतिस्पर्धा और संकेत के एक नाटकीय नुकसान लाती है की ओर जाता है नहीं होना चाहिए . यह भी गैर विशिष्ट दाग से बचने के लिए मध्यवर्ती धुलाई कदम की आवश्यकता तनाव महत्वपूर्ण है ।
हमें पता चला है कि हमारे विधि विभिंन जैविक प्रयोग डिजाइन करने के लिए लागू किया जा सकता है । आनंद लेबल प्रोटोकॉल पहले मुक्तहस्त पार करने के लिए लागू किया गया था सन उपजी (लगभग 150-250 µm मोटी) है कि पहले काट रहे थे और क्लिक के साथ मशीन तैयार monolignols । हालांकि इस डिजाइन रसायन रिपोर्टर की जरूरत मात्रा को कम करने का लाभ है (के रूप में मशीन मात्रा कम कर रहे हैं) और सांख्यिकीय के उत्पादन को बढ़ावा देने की प्रतिकृति, यह नहीं है, कड़ाई से बोल रहा हूं, एक vivo में प्रणाली और कुछ में मामले, असली spatio-लौकिक lignification गतिशीलता के सभी पहलुओं को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं । एक दूसरे प्रयोगात्मक डिजाइन में, हम इसलिए एक विधि है कि पहले से पाइन और gingko27में radiolabeled monolignols के शामिल अध्ययन किया गया था करने के लिए आनंद प्रोटोकॉल अनुकूलित । इस दृष्टिकोण में, जड़ों और स्टेम संयंत्र के शारीरिक रूप से अलग कर रहे है और पूरे स्टेम के आधार क्या ‘ फूल ‘ फूलदान दृष्टिकोण डब किया जा सकता है में monolignol समाधान में मशीन है । छोड़ने के बाद वांछित (गर्मी) समय उपजा है, पार वर्गों में कटौती कर रहे है और आनंद प्रोटोकॉल प्रदर्शन किया । यह हमें दिखाने के लिए अनुमति दी (मैं) कि संशोधित monolignols स्टेम के माध्यम से ले जाया जाता है और सेल दीवारों के भीतर लिग्निन पॉलिमर बढ़ रही है और (द्वितीय) है कि स्थानीयकरण पैटर्न अनिवार्य रूप से पार की धारा के समान था में शामिल कर रहे है दृष्टिकोण. प्रयोग के इस प्रकार के एक असली जीवित संयंत्र में प्रदर्शन किया जा रहा है की योग्यता है/अब प्रयोग और अधिक गहराई से अध्ययन की अनुमति लाइव सेल दृष्टिकोण, लेकिन रासायनिक रिपोर्टर की अधिक से अधिक मात्रा की आवश्यकता है । अंत में, आनंद प्रोटोकॉल भी सन संयंत्र अंकुर के साथ प्रयोग किया जाता था, एक असली जीवित संयंत्र मॉडल जिसमें रासायनिक पत्रकारों जड़ों के माध्यम से अवशोषित किया जा रहा है पहले स्टेम तक ले जाया जा रहा है का प्रतिनिधित्व । हालांकि इस मॉडल का स्पष्ट लाभ है रहने वाले पौधों में प्रदर्शन किया जा रहा है, व्यवहार में, यह युवा अंकुरों तक ही सीमित है और व्यावहारिक कारणों के लिए पुराने पौधों में lignification गतिशीलता की जांच के लिए वास्तव में उपयुक्त नहीं है (लंबी गर्मी समय, ऊंचा रासायनिक पत्रकारों की मात्रा) । फिर भी, इन तीन प्रयोग डिजाइन पूरक है और सभी के साथ अपने पेशेवरों और विपक्ष व्यावहारिक पहलुओं और जैविक महत्व जैविक प्रश्न के प्रकार पर निर्भर करता है के लिए उत्तर दिया जाना है ।
सन में lignification गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए विकसित, हमारे प्रोटोकॉल उच्च अनुकूलनीय न केवल जैविक प्रयोग डिजाइन के मामले में है, लेकिन यह भी अन्य प्रजातियों के पौधे और अंगों के लिए अपने आवेदन के संदर्भ में/ उदाहरण के लिए, आनंद आसानी से Arabidopsis या Populus पीढ़ी है कि और अधिक नॉक आउट के साथ अध्ययन के लिए या दस्तक-नीचे म्यूटेंट विभिंन जीन के लिए उत्तरदाई है स्थानांतरित किया जा सकता है । सिद्धांत रूप में, हमारे दृष्टिकोण के साथ दोहरी लेबलिंग अध्ययन भी संयंत्र सेल दीवार पॉलिमर के दो अलग संशोधित अग्रदूतों का उपयोग करके अंय अणुओं को बढ़ाया जा सकता है-सभी तीन मुख्य monolignols या उनके चयापचय अग्रदूतों सहित के रूप में अच्छी तरह से विभिंन monosaccharides कि polysaccharide मैट्रिक्स का गठन । अपनी स्थापना के बाद से, bioorthogonal रसायन वास्तव में मुख्य रूप से चयापचय oligosaccharide इंजीनियरिंग के माध्यम से glycans/polysaccharides की जांच करने के लिए विकसित किया गया है (मो)4,5,17,28, लेकिन आश्चर्य की बात यह है कि अभी तक जीव विज्ञान संयंत्र के लिए केवल बहुत कुछ आवेदन किया गया है7,8,9,10,11,12। प्रतिक्रियाओं की अनुकूलता के संदर्भ में, लिग्निन के अध्ययन वास्तव में एक जटिल मामले के रूप में दोनों रासायनिक पत्रकारों को एक ही reticulated बहुलक में शामिल कर रहे है हल किया गया । HAZ–gALK पार लिंक गठन की संभावना के लिए 3 डी के भीतर जीALK और एचAZ इकाइयों के स्थानिक निकटता के कारण दूर करने के लिए प्रमुख मुद्दा था लिग्निन23की संरचना, एक सीमा जो मौजूद नहीं हो सकता है यदि दो रासायनिक रिपोर्टर एक ही प्रकार के किसी भी सेल के एक ही स्थानिक क्षेत्र में या जैव बहुलक में शामिल नहीं हैं ।
एक व्यापक क्षेत्र में आनंद पद्धति अनिवार्य रूप से दो अलग रासायनिक एक azide और टर्मिनल alkyne टैग असर पत्रकारों, क्रमशः का उपयोग करते हुए बैक्टीरियल या पशु मॉडल में किसी भी दो रंग प्रतिदीप्ति इमेजिंग अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।
The authors have nothing to disclose.
इस तकनीकी पर्यावरण को प्राप्त करने के लिए अनुकूल प्रदान करने के लिए हम अनुसंधान महासंघ FRABio और TisBio इमेजिंग प्लेटफार्म (उणीव. लील, CNRS, फादर ३६८८, FRABio, BiochimieStructurale एट Fonctionnelle डेस Assemblages Biomoléculaires) के ऋणी हैं । काम.
(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (HAZ) | Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338 | ||
(E)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (GALK) | Synthesized as in Lion et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338 | ||
2% sodium hypochlorite | |||
20 cm high glass tube | |||
250 mL Schott glass bottle | |||
48-well Plate | |||
5/6-TAMRA-PEG3-Azide | Jena Bioscience | CLK-AZ109-1 | |
Aluminium foil | |||
Cheese cloth | |||
Compost containing clay | |||
Coniferyl alcohol (G) | Sigma Aldrich | MFCD00002922 | |
Copper (II) sulfate pentahydrate | |||
DBCO-PEG4-5/6-Carboxyrhodamine 110 | Jena Bioscience | CLK-A127-1 | |
Milli-Q Ultrapure water | |||
Eppendorf 1,5 mL | |||
EtOH | |||
Flax seeds (L. usitatissimum L.) | |||
Fluoromount-G™ Slide Mounting Medium | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
Glass coverslip | |||
Glass microscope slide | |||
Growth chamber | CLF-Plant Climatics | For 2-week-old plants culture | |
Growth chamber | Angelantoni Life Sciences | For 2-month-old plants culture | |
Magenta plant culture box | For 2-week-old seedling culture | ||
Methanol | Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), work with gloves under a hood | ||
Micropipette | |||
Nail polish | |||
Nikon A1R confocal microscope | Nikon | ||
Orbital shaker | |||
Parafilm | |||
p-Coumaryl alcohol (H) | Carbosynth | FC145653 | |
Plastic cap | |||
Plastic pipette | |||
Plastic pot | For 2-month-old plants culture | ||
Razor blade | |||
Rubber band | |||
Sodium Ascorbate | |||
Sterile clamp | |||
Vertical support | |||
Vortex | |||
Reagents for liquid and solid ½ MS medium | |||
KH2PO4 | |||
KNO3 | |||
NH4NO3 | |||
MgSO4.7H2O | |||
CaCl2.2H2O | |||
MnSO4.H2O | |||
ZnSO4.7H2O | |||
H3BO3 | |||
KI | |||
Na2MoO4.2H2O | |||
CuSO4.5H2O | |||
CoCl2.6H2O | |||
Na2EDTA.2H2O | |||
FeSO4.7H2O | |||
Thiamine.HCl | |||
Pyridoxine.HCl | |||
Glycine | |||
Nicotinic acid | |||
Myo-inositol | |||
Saccharose | |||
MES hydrate | |||
Agar |