الجمع بين علم البلورات بالأشعة السينية بزاوية صغيرة تبعثر الأشعة السينية نموذج المناطق غير منظم من Nsa1 من سيريفيسيا س.
Summary
هذا الأسلوب يصف الاستنساخ، والتعبير، وتنقية Nsa1 المؤتلف للتصميم الهيكلي البلورات بالأشعة السينية بزاوية صغيرة تبعثر الأشعة السينية (ساكسس)، وقابلاً للتطبيق لتحليل البروتينات الأخرى الهيكلية الهجين يحتوي على كل أمر واضطرابه المجالات.
Abstract
تحديد طول بنية الريبوسوم الجمعية عامل Nsa1 من Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) يشكل تحديا بسبب اضطرابه وحوزتي مجا تيرمينوس ج من البروتين. هذه المخطوطة يصف الأساليب لتنقية Nsa1 المؤتلف من S. cerevisiae للتحليل الهيكلي ساكسس بعلم البلورات بالأشعة السينية. علم البلورات بالأشعة السينية واستخدم حل بنية المجال WD40 الطرفي ن أمر جيد من Nsa1، وثم استخدمت ساكسس لحل هيكل ج-محطة Nsa1 في الحل. الحل تشتت بيانات جمعت من كامل طول Nsa1 في الحل. ثم كشفت مزيجاً من هيئة جامدة و أساسه النمذجة ج-محطة Nsa1، وحسبت ستريك نثر النظرية من هيكل كريستال عالية الدقة للمجال WD40. من خلال هذا النهج الهجين أعيد هيكل رباعي من البروتين الكامل. الأساليب المقدمة هنا ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق عموما لتحديد الهيكلية الهجين من غيرها من البروتينات التي تتكون من خليط مجالات منظم وغير منظم.
Introduction
ريبوسوم هي الآلات ريبونوكليوبروتين الكبيرة التي تضطلع بالدور الأساسي لترجمة مرناً إلى البروتينات في جميع الخلايا الحية. ريبوسوم تتكون من وحدتين فرعيتين التي تنتج في عملية معقدة ووصف الريبوسوم نشوء حيوي1،2،،من34. الجمعية الريبوسوم التوكسينات تعتمد على معونة مئات من الجمعية ريبوسومال أساسي العوامل2،،من35. Nsa1 (Nop7 المرتبطة 1) هو عامل الجمعية الريبوسوم التوكسينات مطلوب على وجه التحديد لإنتاج وحدة فرعية ريبوسومال كبيرة6، وهي المعروفة باسم WD-كرر تتضمن 74 (WDR74) في أعلى الكائنات الحية7. لقد ثبت WDR74 أن تكون مطلوبة من أجل تشكيل الكيسة في الفئران8وهو كثيرا ما تحور المروج WDR74 في خلايا السرطان9. ومع ذلك، الدالة واليات دقيقة من Nsa1/WDR74 في الريبوسوم الجمعية لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. للبدء في الكشف عن دور Nsa1/WDR74 أثناء النضج الريبوسوم حقيقية النواة، أجريت تحليلات هيكلية متعددة، بما في ذلك علم البلورات بالأشعة السينية، وزاوية صغيرة بالأشعة السينية ونثر (ساكسس)10.
مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) والمجهر الإلكتروني، علم البلورات بالأشعة السينية وساكسس تقنيات هامة لدراسة بنية الجزيئات. الحجم والشكل، وتوافر واستقرار الجزيئات تأثيرات تناسب أسلوب الأحياء الهيكلية التي ستكون أفضل جزيء ضخم خاص، غير أن الجمع بين تقنيات متعددة من خلال اتباع نهج ما يسمى “هجينة” أصبح 11من أداة مفيدة على نحو متزايد. لا سيما علم البلورات بالأشعة السينية وساكسس أساليب قوية ومتكاملة للتصميم الهيكلي للجزيئات الكبيرة12.
علم البلورات توفر هياكل الذرية ذات الدقة العالية بدءاً من الجزيئات الصغيرة إلى الآلية الخلوية الكبيرة مثل الريبوسوم، وقد أدى إلى تحقيق إنجازات عديدة في فهم الوظائف البيولوجية للبروتينات وغيرها 13من الجزيئات الكبيرة. وعلاوة على ذلك، يسخر تصميم الأدوية على أساس هيكل سلطة هياكل الكريستال للالتحام الجزيئية بطرق حسابية، مضيفاً بعدا حاسما ل اكتشاف وتطوير العقاقير14. على الرغم من انطباق واسع النطاق، نظم مرنة واضطرابه تحديا لتقييم علم البلورات حيث يمكن أن تعوق التعبئة كريستال أو إلكترون كثافة الخرائط قد تكون ناقصة أو من نوعية رديئة. على العكس من ذلك، ساكسس نهجاً هيكلي القائم على الحل ومنخفضة الدقة قادرة على وصف نظم مرنة تتراوح بين الحلقات اضطرابه وتيرميني البروتينات جوهريا اضطرابه12،،من1516. معتبرا أنها متوافقة مع مجموعة واسعة من أحجام الجسيمات12، ساكسس العمل تآزر مع علم البلورات لتوسيع نطاق الأسئلة البيولوجية التي يمكن أن تتناولها الدراسات الهيكلية.
Nsa1 مناسبة لاتباع نهج هيكلية هجين لأنه يحتوي على مجال WD40 جيد التنظيم متبوعاً الوظيفية، ولكن مرنة ج-محطة التي ليست قابلة لأساليب علم البلورات بالأشعة السينية. التالي بروتوكول للاستنساخ، والتعبير، وتنقية Nsa1 S. cerevisiae لتحديد الهيكلية الهجين بعلم البلورات بالأشعة السينية وساكسس. هذا البروتوكول يمكن تكييفها لدراسة هياكل غيرها من البروتينات التي تتكون من خليط من مناطق مرتبة واضطرابه.
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام هذا البروتوكول، ولدت الدراسات الهيكلية Nsa1 المؤتلف من S. cerevisiae ساكسس بعلم البلورات بالأشعة السينية. وقد تصرفت بشكل جيد في حل Nsa1 وتبلورت في أشكال بلورية متعددة. وخلال الاستفادة المثلى من هذه البلورات، اكتشف أن ج-محطة Nsa1 كانت حساسة لتدهور حوزتي. عالية الدقة، يمكن فقط تكرار نموذج…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وجمعت البيانات حيود في “جنوب شرق الإقليمي وصول الفريق التعاوني” (SER-القط) 22-معرف و 22-BM بيملينيس في المتقدم فوتون المصدر (الجزائرية)، “مختبر أرغون الوطني”. وجمعت البيانات ساكسس على بيمليني العرافات في تقدم الضوء المصدر (ALS)، “مختبر لورنس بيركلي الوطني”. ونود أن نشكر الموظفين في بيامليني العرافات لمساعدتهم بجمع بيانات الاستشعار عن بعد ومعالجة. ونحن ممتنون لبحوث قياس الطيف الكتلي الكتلة الوطنية معهد لعلوم الصحة البيئية (نيس) وفريق الدعم للحصول على مساعدة في تحديد حدود المجال البروتين. وأيد هذا العمل “لنا المعهد من البرنامج الصحي الوطني داخلية البحوث”؛ المعهد الوطني الأمريكي لعلوم الصحة البيئية (نيس) (ES103247 ضياء أن ر. أ. س.) والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (استوفوا، 146626 إلى M.C.P). استخدام لوكالة الأنباء الجزائرية يدعمه مكتب علوم الطاقة الأساسية تحت “رقم العقد” ومكتب العلوم ووزارة الطاقة الأمريكية ث-31-109-إنكلترا-38. وأيده الاستخدام من مصدر الضوء المتقدم (ALS) مدير مكتب العلوم بمكتب علوم الطاقة الأساسية، من “وزارة الطاقة الأميركية” تحت “رقم العقد” دي-AC02-05CH11231. دعم إضافي بيمليني “ساكسس العرافات” يأتي من “المعهد الوطني للصحة” مشروع مينوس (R01GM105404) والراقية الأجهزة منحة S10OD018483. ونود أيضا أن أشكر القمر أندريا والدكتور أندريس سارة قراءة نقدية لهذه المخطوطة.
Materials
| Molecular Cloning of Nsa1 | |||
| pMBP2 parallel vector | Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) | We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP) | |
| S. cerevisiae genomic DNA | ATCC | 204508D-5 | |
| Primers for cloning Nsa1 | |||
| SC_Nsa1_FLFw | IDT | CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT GGATAG |
|
| SC_Nsa1_FLRv | IDT | AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC AGC |
|
| SC_Nsa1_DeltaCFw | IDT | GGGCGCCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGG |
|
| SC_Nsa1_DeltaCRv | IDT | GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTGCTTCCC |
|
| Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1 | |||
| Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells | Invitrogen | C601003 | |
| pMBP- NSA1 and various truncations | Lo et al., 2017 | ||
| Selenomethionine | Molecular Dimensions | MD12-503B | |
| IPTG, Dioxane-Free | Promega | V3953 | |
| EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| Sodium Chloride | Caledon Laboratory Chemicals | 7560-1-80 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Tris Buffer, 1 M pH7.5 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-029 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 1M Imidazole, pH 8.0 | Teknova | I6980-06 | |
| Talon Affinity Resin | Clonetech | 635503 | |
| Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) | Millipore | UFC901024 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column | GE-Healthcare | 28989335 | |
| TEV Protease | Prepared by NIEHS Protein Expression Core | Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009) | |
| 4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRad | 456-8056 | |
| Crystallization, Proteolytic Screening | |||
| Crystal Screen | Hampton Research | HR2-110 | |
| Crystal Screen 2 | Hampton Research | HR2-112 | |
| Salt Rx | Hampton Research | HR2-136 | |
| Index Screen | Hampton Research | HR2-144 | |
| PEG/Ion Screen | Hampton Research | HR2-139 | |
| JCSG+ | Molecular Dimensions | MD1-37 | |
| Wizard Precipitant Synergy | Molecular Dimensions | MD15-PS-T | |
| Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates | TTP Labtech | 4150-05823 | |
| 3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR4-506 | |
| Proti-Ace Kit | Hampton Research | HR2-429 | |
| PEG 1500 | Molecular Dimensions | MD2-100-6 | |
| PEG 400 | Molecular Dimensions | MD2-100-3 | |
| HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 | Molecular Dimensions | MD2-011- | |
| Sodium Citrate tribasic | Molecular Dimensions | MD2-100-127 | |
| 22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides | Hampton Research | HR3-231 | |
| 24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) | Hampton Research | HR3-172 | |
| 18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) | Hampton Research | HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971 | |
| Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| Magnetic Crystal Caps | Hampton Research | HR4-779 | |
| Magnetic Cryo Wand | Hampton Research | HR4-729 | |
| Cryogenic Foam Dewar | Hampton Research | HR4-673 | |
| Crystal Puck System | MiTeGen | M-CP-111-021 | |
| Full Skirt 96 well Clear Plate | VWR | 10011-228 | |
| AxyMat Sealing Mat | VWR | 10011-130 | |
| Equipment | |||
| UVEX-m | JAN Scientific, Inc. | ||
| Nanodrop Lite Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ||
| Mosquito Robot | TTP Labtech | ||
| Software/Websites | |||
| HKL2000 | Otwinoski and Minor, 1997 | ||
| Phenix | Adams et al., 2010 | ||
| Coot | Emsley et al., 2010 | ||
| ATSAS | Petoukhov et al., 2012 | https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/ | |
| Scatter | Rambo and Tainer, 2013 | ||
| Pymol | The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC. | ||
| BUNCH | Petoukhov and Svergun, 2005 | ||
| CRYSOL | Svergun et al, 1995 | ||
| PRIMUS | Konarev et al, 2003 | ||
| EOM | Tria et al, 2015 |
References
- Thomson, E., Ferreira-Cerca, S., Hurt, E. Eukaryotic ribosome biogenesis at a glance. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 4815-4821 (2013).
- Woolford, J. L., Baserga, S. J. Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).
- Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. A Puzzle of Life: Crafting Ribosomal Subunits. Trends Biochem Sci. , (2017).
- Tomecki, R., Sikorski, P. J., Zakrzewska-Placzek, M. Comparison of preribosomal RNA processing pathways in yeast, plant and human cells – focus on coordinated action of endo- and exoribonucleases. FEBS Lett. , (2017).
- Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. Driving ribosome assembly. Biochim Biophys Acta. 1803 (6), 673-683 (2010).
- Kressler, D., Roser, D., Pertschy, B., Hurt, E. The AAA ATPase Rix7 powers progression of ribosome biogenesis by stripping Nsa1 from pre-60S particles. J Cell Biol. 181 (6), 935-944 (2008).
- Hiraishi, N., Ishida, Y., Nagahama, M. AAA-ATPase NVL2 acts on MTR4-exosome complex to dissociate the nucleolar protein WDR74. Biochem Biophy Res Co. 467 (3), 534-540 (2015).
- Maserati, M., et al. Wdr74 is required for blastocyst formation in the mouse. PLoS One. 6 (7), e22516 (2011).
- Weinhold, N., Jacobsen, A., Schultz, N., Sander, C., Lee, W. Genome-wide analysis of noncoding regulatory mutations in cancer. Nat Genet. 46 (11), 1160-1165 (2014).
- Lo, Y. H., Romes, E. M., Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. Structural Analysis Reveals Features of Ribosome Assembly Factor Nsa1/WDR74 Important for Localization and Interaction with Rix7/NVL2. Structure. 25 (5), 762-772 (2017).
- Lander, G. C., Saibil, H. R., Nogales, E. Go hybrid: EM, crystallography, and beyond. Curr Opin Struc Biol. 22 (5), 627-635 (2012).
- Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution. Q Rev Biophys. 40 (3), 191-285 (2007).
- Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281 (18), 3985-4009 (2014).
- Zheng, H., et al. X-ray crystallography over the past decade for novel drug discovery – where are we heading next?. Expert Opin Drug Dis. 10 (9), 975-989 (2015).
- Kikhney, A. G., Svergun, D. I. A practical guide to small angle X-ray scattering (SAXS) of flexible and intrinsically disordered proteins. FEBS Lett. 589 (19 Pt A), 2570-2577 (2015).
- Bernado, P., Mylonas, E., Petoukhov, M. V., Blackledge, M., Svergun, D. I. Structural characterization of flexible proteins using small-angle X-ray scattering. J Am Chem Soc. 129 (17), 5656-5664 (2007).
- Sheffield, P., Garrard, S., Derewenda, Z. Overcoming expression and purification problems of RhoGDI using a family of “parallel” expression vectors. Protein Expres Purif. 15 (1), 34-39 (1999).
- Doublie, S. Preparation of selenomethionyl proteins for phase determination. Methods Enzymol. 276, 523-530 (1997).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
- Wlodawer, A., Minor, W., Dauter, Z., Jaskolski, M. Protein crystallography for aspiring crystallographers or how to avoid pitfalls and traps in macromolecular structure determination. FEBS J. 280 (22), 5705-5736 (2013).
- Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Macromolecular Crystallography, Pt A. 276, 307-326 (1997).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 213-221 (2010).
- Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D. 67 (Pt 4), 235-242 (2011).
- Terwilliger, T. C., et al. Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: the PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallographica Section D. 65, 582-601 (2009).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallogr D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
- Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallogr D. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
- McCoy, A. J. Solving structures of protein complexes by molecular replacement with Phaser. Acta Crystallogr D. 63 (Pt 1), 32-41 (2007).
- McCoy, A. J., et al. Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr. 40 (Pt 4), 658-674 (2007).
- Dyer, K. N., et al. High-throughput SAXS for the characterization of biomolecules in solution: a practical approach. Methods Mol Biol. 1091, 245-258 (2014).
- Forster, S., Apostol, L., Bras, W. Scatter: software for the analysis of nano- and mesoscale small-angle scattering. J Appl Crystallogr. 43, 639-646 (2010).
- Petoukhov, M. V., et al. New developments in the ATSAS program package for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 45, 342-350 (2012).
- Konarev, P. V., Volkov, V. V., Sokolova, A. V., Koch, M. H. J., Svergun, D. I. PRIMUS: a Windows PC-based system for small-angle scattering data analysis. J Appl Crystallogr. 36, 1277-1282 (2003).
- Svergun, D. I. Determination of the Regularization Parameter in Indirect-Transform Methods Using Perceptual Criteria. J Appl Crystallogr. 25, 495-503 (1992).
- Rambo, R. P., Tainer, J. A. Accurate assessment of mass, models and resolution by small-angle scattering. Nature. 496 (7446), 477-481 (2013).
- Petoukhov, M. V., Svergun, D. I. Global rigid body modeling of macromolecular complexes against small-angle scattering data. Biophys J. 89 (2), 1237-1250 (2005).
- Tria, G., Mertens, H. D., Kachala, M., Svergun, D. I. Advanced ensemble modelling of flexible macromolecules using X-ray solution scattering. IUCrJ. 2 (Pt 2), 207-217 (2015).
- Svergun, D., Barberato, C., Koch, M. H. J. CRYSOL – A program to evaluate x-ray solution scattering of biological macromolecules from atomic coordinates. J Appl Crystallogr. 28, 768-773 (1995).
- . The PyMOL Molecular Graphics System Version 1.8 Available from: https://pymol.org (2015)
- Pelikan, M., Hura, G. L., Hammel, M. Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering. Gen Physiol Biophys. 28 (2), 174-189 (2009).
- Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. Protein stability: a crystallographer’s perspective. Acta Crystallogr F. 72 (Pt 2), 72-95 (2016).
- Hinsen, K. Structural flexibility in proteins: impact of the crystal environment. Bioinformatics. 24 (4), 521-528 (2008).
- Shtykova, E. V., et al. Structural analysis of influenza A virus matrix protein M1 and its self-assemblies at low pH. PLoS One. 8 (12), e82431 (2013).
- Mallam, A. L., et al. Solution structures of DEAD-box RNA chaperones reveal conformational changes and nucleic acid tethering by a basic tail. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12254-12259 (2011).
- Papaleo, E., et al. The Role of Protein Loops and Linkers in Conformational Dynamics and Allostery. Chem Rev. 116 (11), 6391-6423 (2016).
- Rozycki, B., Boura, E. Large, dynamic, multi-protein complexes: a challenge for structural biology. J Phys Condens Matter. 26 (46), 463103 (2014).
- Schlundt, A., Tants, J. N., Sattler, M. Integrated structural biology to unravel molecular mechanisms of protein-RNA recognition. Methods. 118, 119-136 (2017).
- Thompson, M. K., Ehlinger, A. C., Chazin, W. J. Analysis of Functional Dynamics of Modular Multidomain Proteins by SAXS and NMR. Methods Enzymol. 592, 49-76 (2017).
