एक्स-रे क्रि छोटे कोण एक्स-रे के साथ Nsa1 के मॉडल unस्ट्रक्चर्ड क्षेत्रों को तितर बितर के साथ संयोजन एस Cerevisiae से
Summary
यह विधि एक्स-रे क्रि और छोटे कोण एक्स-रे कैटरिंग (SAXS) द्वारा संरचनात्मक निर्धारण के लिए संयोजक Nsa1 की क्लोनिंग, अभिव्यक्ति, और शुद्धि का वर्णन करता है, और अन्य प्रोटीन के संकर संरचनात्मक विश्लेषण के लिए लागू है जिसमें आदेश दिया और परिक्रमा डोमेन दोनों शामिल हैं ।
Abstract
Saccharomyces cerevisiae (एस. cerevisiae) से ribosome असेंबली फैक्टर Nsa1 की पूर्ण लंबाई संरचना का निर्धारण, प्रोटीन की परिक्रमा और चिढ़ाने labile सी-टर्मिनस की वजह से चुनौतीपूर्ण है । इस पांडुलिपि में एक्स-रे क्रि और SAXS दोनों द्वारा संरचनात्मक विश्लेषण के लिए एस cerevisiae से संयोजक Nsa1 को शुद्ध करने के तरीकों का वर्णन है । एक्स-रे क्रि Nsa1 के अच्छी तरह से आदेश दिया एन टर्मिनल WD40 डोमेन की संरचना को हल करने के लिए उपयोग किया गया था, और फिर SAXS समाधान में Nsa1 के सी-टर्मिनस की संरचना को हल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । समाधान कैटरिंग डेटा पूर्ण-लंबाई Nsa1 से समाधान में एकत्रित किया गया था । सैद्धांतिक कैटरिंग आयाम WD40 डोमेन के उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रिस्टल संरचना से परिकलित किए गए थे, और फिर कठोर शरीर और ab initio मॉडलिंग का संयोजन Nsa1 के सी-टर्मिनस से पता चला । इस संकर दृष्टिकोण के माध्यम से पूरे प्रोटीन की चतुर्धातुक संरचना को खंगाला गया । यहां प्रस्तुत तरीकों आमतौर पर संकर संरचनात्मक निर्धारण के लिए लागू किया जाना चाहिए अंय प्रोटीन संरचित और unस्ट्रक्चर्ड डोमेन का मिश्रण से बना ।
Introduction
Ribosomes बड़े ribonucleoprotein मशीनों है कि सभी जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन में mRNA अनुवाद की आवश्यक भूमिका को पूरा कर रहे हैं । Ribosomes एक जटिल प्रक्रिया में उत्पादित कर रहे हैं जो दो उपइकाईयों से बना रहे हैं ribosome उत्पत्ति1,2,3,4. युकेरियोटिक ribosome विधानसभा आवश्यक राइबोसोमल विधानसभा कारकों में से सैकड़ों की सहायता पर निर्भर करता है2,3,5। Nsa1 (Nop7 जुड़े 1) एक युकेरियोटिक ribosome विधानसभा कारक है कि विशेष रूप से बड़े राइबोसोमल उपइकाई6के उत्पादन के लिए आवश्यक है, और WD-दोहराने युक्त ७४ (WDR74) उच्च जीवों में7के रूप में जाना जाता है । WDR74 चूहों में ब्लास्टोसिस्ट गठन के लिए आवश्यक हो दिखाया गया है8और WDR74 प्रमोटर अक्सर कैंसर कोशिकाओं में रूपांतरित हो जाता है9. हालांकि, समारोह और ribosome विधानसभा में Nsa1/WDR74 के सटीक तंत्र अभी भी काफी हद तक अनजान हैं । युकेरियोटिक ribosome परिपक्वता के दौरान Nsa1/WDR74 की भूमिका को उजागर करने के लिए शुरू करने के लिए, कई संरचनात्मक विश्लेषण एक्स-रे क्रि और छोटे कोण एक्स-रे कैटरिंग (SAXS)10सहित प्रदर्शन किया गया था, ।
एक्स-रे क्रि, नाभिकीय चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, और SAXS macromolecular संरचना के अध्ययन के लिए सभी महत्वपूर्ण तकनीक हैं । आकार, आकार, उपलब्धता, और अणुओं की स्थिरता के लिए संरचनात्मक जीवविज्ञान पद्धति है जो एक विशेष macromolecule सबसे अच्छा अनुकूल हो जाएगा प्रभावित करता है, लेकिन एक तथाकथित “संकर दृष्टिकोण” के माध्यम से कई तकनीकों के संयोजन होता जा रहा है तेजी से लाभकारी उपकरण11. विशेष रूप से एक्स-रे क्रि और SAXS अणुओं12के संरचनात्मक निर्धारण के लिए शक्तिशाली और पूरक तरीके हैं ।
क्रि छोटे अणुओं से इस तरह के ribosome के रूप में बड़े सेलुलर मशीनरी को लेकर उच्च संकल्प परमाणु संरचनाओं प्रदान करता है, और प्रोटीन और अन्य के जैविक कार्यों की समझ में कई सफलताओं के लिए नेतृत्व किया है अणुओं१३। इसके अलावा, संरचना आधारित दवा डिजाइन अभिकलनी तरीकों से आणविक डॉकिंग के लिए क्रिस्टल संरचनाओं की शक्ति का दोहन, दवा की खोज और विकास के लिए एक महत्वपूर्ण आयाम जोड़ने14। अपनी व्यापक प्रयोज्यता के बावजूद, लचीला और परिक्रमित प्रणालियों के बाद से क्रि द्वारा आकलन करने के लिए चुनौती दे रहे है क्रिस्टल पैकिंग या रुकावट हो सकता है इलेक्ट्रॉन घनत्व नक्शे अधूरा या खराब गुणवत्ता का हो सकता है । इसके विपरीत, SAXS एक समाधान आधारित और कम संकल्प संरचनात्मक दृष्टिकोण को परिक्रमा छोरों और टर्मिनी से आंतरिक रूप से परिक्रमित प्रोटीन12,15,16से लेकर प्रणालियों का वर्णन करने में सक्षम है । विचार यह कण आकार12की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ संगत है, SAXS क्रि के साथ synergistically काम करने के लिए जैविक प्रश्न है कि संरचनात्मक अध्ययन द्वारा संबोधित किया जा सकता है की सीमा का विस्तार कर सकते हैं ।
Nsa1 एक संकर संरचनात्मक दृष्टिकोण के लिए उपयुक्त है क्योंकि यह एक अच्छी तरह से संरचित WD40 एक कार्यात्मक द्वारा पीछा डोमेन शामिल है, लेकिन लचीला सी-टर्मिनस जो एक्स-रे क्रि तरीकों के लिए उत्तरदायी नहीं है । निंनलिखित एक्स-रे क्रि और SAXS द्वारा संकर संरचनात्मक निर्धारण के लिए क्लोनिंग, अभिव्यक्ति, और एस cerevisiae Nsa1 के शोधन के लिए एक प्रोटोकॉल है । इस प्रोटोकॉल का आदेश दिया और परिक्रमा क्षेत्रों का एक संयोजन के शामिल हैं कि अन्य प्रोटीन की संरचनाओं का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर, संयोजक Nsa1 से एस cerevisiae दोनों एक्स-रे क्रि और SAXS द्वारा संरचनात्मक अध्ययन के लिए उत्पंन किया गया था । Nsa1 समाधान में अच्छी तरह से व्यवहार किया गया था और कई क्रिस्टल रूपों में सघन । इ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
विवर्तन डेटा दक्षिण पूर्व क्षेत्रीय सहयोगी का उपयोग टीम (SER-कैट) 22 आईडी और 22-बीएम beamlines उंनत फोटॉन स्रोत (ए पी एस), Argonne राष्ट्रीय प्रयोगशाला में एकत्र किए गए । SAXS डेटा अग्रिम प्रकाश स्रोत (एस), लॉरेंस बर्कले राष्ट्रीय प्रयोगशाला में SIBYLS beamline पर एकत्र किया गया था । हम दूरदराज के डेटा संग्रह और प्रसंस्करण के साथ उनकी मदद के लिए SIBYLS beamline पर कर्मचारियों को धंयवाद देना चाहूंगा । हम राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान (NIEHS) जन स्पेक्ट्रोमेट्री अनुसंधान और सहायता समूह के लिए आभारी है प्रोटीन डोमेन सीमाएं निर्धारित करने में मदद के लिए । इस काम को अमेरिका के नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ हेल्थ अंदर रिसर्च प्रोग्राम ने सपोर्ट किया था; अमेरिका के राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान (NIEHS) (जिया ES103247 को आर. ई. एस.) और स्वास्थ्य अनुसंधान के कनाडाई संस्थान (CIHR, १४६६२६ को एम. सी. पी.). ए पी एस का उपयोग अमेरिका के ऊर्जा विभाग, विज्ञान कार्यालय, बुनियादी ऊर्जा विज्ञान के कार्यालय के तहत अनुबंध सं द्वारा समर्थित किया गया था । डब्ल्यू-31-109-अभियांत्रिकी-३८ । उंनत प्रकाश स्रोत (एस) का उपयोग निदेशक, विज्ञान के कार्यालय, बुनियादी ऊर्जा विज्ञान के कार्यालय, अनुबंध सं के तहत ऊर्जा विभाग के अमेरिका के द्वारा समर्थित था । DE-AC02-05CH11231 । SIBYLS SAXS beamline के लिए अतिरिक्त सहायता राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान परियोजना MINOS (R01GM105404) और एक उच्च अंत इंस्ट्रूमेंटेशन अनुदान S10OD018483 से आता है । हम भी इस पांडुलिपि के अपने महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Andrea चंद्रमा और डॉ सारा एंड्रेस शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।
Materials
| Molecular Cloning of Nsa1 | |||
| pMBP2 parallel vector | Sheffield et al, Protein Expression and Purification 15, 34-39 (1999) | We used a modified version of pMBP2 which included an N-terminal His-tag (pHMBP) | |
| S. cerevisiae genomic DNA | ATCC | 204508D-5 | |
| Primers for cloning Nsa1 | |||
| SC_Nsa1_FLFw | IDT | CGC CAA AGG CCT ATGAGGTTACTAGTCAGCTGTGT GGATAG |
|
| SC_Nsa1_FLRv | IDT | AATGCAGCGGCCGCTCAAATTTT GCTTTTCTTACTGGCTTTAGAAGC AGC |
|
| SC_Nsa1_DeltaCFw | IDT | GGGCGCCATGGGATCCATGAGG TTACTAGTCAGCTGTGTGG |
|
| SC_Nsa1_DeltaCRv | IDT | GATTCGAAAGCGGCCGCTTAAAC CTTCCTTTTTTGCTTCCC |
|
| Recombinant Protein Production and Purification of Nsa1 | |||
| Escherichia coli BL21 (DE3) Star Cells | Invitrogen | C601003 | |
| pMBP- NSA1 and various truncations | Lo et al., 2017 | ||
| Selenomethionine | Molecular Dimensions | MD12-503B | |
| IPTG, Dioxane-Free | Promega | V3953 | |
| EDTA Free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | |
| Sodium Chloride | Caledon Laboratory Chemicals | 7560-1-80 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Tris Buffer, 1 M pH7.5 | KD Medical | RGF-3340 | |
| Glycerol | Invitrogen | 15514-029 | |
| beta-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| 1M Imidazole, pH 8.0 | Teknova | I6980-06 | |
| Talon Affinity Resin | Clonetech | 635503 | |
| Amicon Ultra 15 mL Centrifugal Filter (MWCO 10K) | Millipore | UFC901024 | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 Prep Grade Gel Filtration Column | GE-Healthcare | 28989335 | |
| TEV Protease | Prepared by NIEHS Protein Expression Core | Expression plasmid provided by NCI (Tropea et al. Methods Mol Biology, 2009) | |
| 4-15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels | BioRad | 456-8056 | |
| Crystallization, Proteolytic Screening | |||
| Crystal Screen | Hampton Research | HR2-110 | |
| Crystal Screen 2 | Hampton Research | HR2-112 | |
| Salt Rx | Hampton Research | HR2-136 | |
| Index Screen | Hampton Research | HR2-144 | |
| PEG/Ion Screen | Hampton Research | HR2-139 | |
| JCSG+ | Molecular Dimensions | MD1-37 | |
| Wizard Precipitant Synergy | Molecular Dimensions | MD15-PS-T | |
| Swissci 96-well 3-drop UVP sitting drop plates | TTP Labtech | 4150-05823 | |
| 3inch Wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton Research | HR4-506 | |
| Proti-Ace Kit | Hampton Research | HR2-429 | |
| PEG 1500 | Molecular Dimensions | MD2-100-6 | |
| PEG 400 | Molecular Dimensions | MD2-100-3 | |
| HEPES/sodium hydroxide pH 7.5 | Molecular Dimensions | MD2-011- | |
| Sodium Citrate tribasic | Molecular Dimensions | MD2-100-127 | |
| 22 mm x 0.22 mm Siliconized Coverslides | Hampton Research | HR3-231 | |
| 24 Well Plates with sealant (VDX Plate with Sealant) | Hampton Research | HR3-172 | |
| 18 mM Mounted Nylon Loops (0.05 mm to 0.5 mM) | Hampton Research | HR4-945, HR4-947, HR4-970, HR4-971 | |
| Seed Bead Kit | Hampton Research | HR2-320 | |
| Magnetic Crystal Caps | Hampton Research | HR4-779 | |
| Magnetic Cryo Wand | Hampton Research | HR4-729 | |
| Cryogenic Foam Dewar | Hampton Research | HR4-673 | |
| Crystal Puck System | MiTeGen | M-CP-111-021 | |
| Full Skirt 96 well Clear Plate | VWR | 10011-228 | |
| AxyMat Sealing Mat | VWR | 10011-130 | |
| Equipment | |||
| UVEX-m | JAN Scientific, Inc. | ||
| Nanodrop Lite Spectrophotometer | Thermo-Fisher | ||
| Mosquito Robot | TTP Labtech | ||
| Software/Websites | |||
| HKL2000 | Otwinoski and Minor, 1997 | ||
| Phenix | Adams et al., 2010 | ||
| Coot | Emsley et al., 2010 | ||
| ATSAS | Petoukhov et al., 2012 | https://www.embl-hamburg.de/biosaxs/atsas-online/ | |
| Scatter | Rambo and Tainer, 2013 | ||
| Pymol | The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.8 Schrödinger, LLC. | ||
| BUNCH | Petoukhov and Svergun, 2005 | ||
| CRYSOL | Svergun et al, 1995 | ||
| PRIMUS | Konarev et al, 2003 | ||
| EOM | Tria et al, 2015 |
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