ट्रांस-इनर सेल भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के इंजेक्शन उच्च Chimerism दरों की ओर जाता है
Summary
यहां हम नए उपकरणों के उपयोग के बिना कल्पना उत्पादन बढ़ाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इंजेक्शन के लिए भ्रूण का एक सरल अभिविन्यास परिवर्तन उत्पादित भ्रूण की संख्या में वृद्धि कर सकते हैं, और संभावित germline संचरण के लिए समय रेखा को कम.
Abstract
ES सेल के तरीके के माध्यम से आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के निर्माण में दक्षता बढ़ाने के प्रयास में, हम वर्तमान ब्लास्टोसिस्ट इंजेक्शन प्रोटोकॉल के लिए एक अनुकूलन प्रस्तुत करते हैं । यहां हम रिपोर्ट है कि भ्रूण का एक सरल रोटेशन, और ट्रांस के माध्यम से इंजेक्शन इनर-आंतरिक कोशिका (TICM) 31% से ५०% से chimeric चूहों का प्रतिशत बढ़ा, कोई अतिरिक्त उपकरण या आगे विशेष प्रशिक्षण के साथ । 26 विभिंन नस्ल क्लोन, और ३५ कुल क्लोन 9 महीने की अवधि में इंजेक्शन थे । या तो गर्भावस्था दर या पारंपरिक इंजेक्शन तकनीक और TICM के बीच भ्रूण की वसूली की दर में कोई महत्वपूर्ण अंतर था । इसलिए, इंजेक्शन प्रक्रिया में किसी भी बड़े परिवर्तन और ब्लास्टोसिस्ट के एक साधारण स्थिति और आईसीएम के माध्यम से इंजेक्शन के बिना, blastocoel गुहा में ES कोशिकाओं को रिहा संभावित chimeric उत्पादन और बाद की मात्रा में सुधार कर सकते हैं germline ट्रांसमिशन.
Introduction
लगभग 25 वर्षों के लिए, आनुवंशिक रूप से लक्षित चूहों के निर्माण के लिए एक धीमी प्रक्रिया रही है, अक्सर germline संचारण chimeras की पीढ़ी के लिए blastocysts ES सेल microinjection मंच पर एक टोंटी द्वारा बाधा । CRISPR/Cas91सहित हाल ही की प्रगति,2 es कोशिकाओं और उच्च प्रवाह es KOMP तरह सेल पीढ़ी के संघ में लक्ष्यीकरण, आनुवंशिक रूप से संशोधित ES कोशिकाओं की पीढ़ी/ हालांकि, germline chimeras की पीढ़ी इन ES कोशिकाओं3,4से आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों बनाने में एक अड़चन बनी हुई है । उच्च प्रवाह es सेल जनरेशन परियोजनाएं es सेल गुणवत्ता में उच्च परिवर्तनशीलता से त्रस्त किया गया है, जो germline chimeras के सफल निर्माण के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अतिरिक्त, सामांयतः उपयोग की जाने वाली कुछ कक्ष रेखाओं को उच्च aneuploidy, और germline सक्षम chimeras5के कठिन उत्पादन के लिए जाना जाता है ।
कई तरीकों या तो एक उच्च कल्पना, या पूरी तरह से ES सेल चूहों6,7,8,9,10के साथ चूहों बनाने के लिए विकसित किया गया है । जबकि इनमें से प्रत्येक सिस्टम की अपनी योग्यता होती है, लेकिन उनमें भी उनकी कमियाँ हैं । tetraploid chimeras की पीढ़ी है, जबकि १००% ES सेल व्युत्पंन चूहों पैदा करने, अक्षम है, और आम तौर पर लाइनों 5,6नस्ल को सीमित । मोरूला इंजेक्शन के नए तरीकों उच्च प्रतिशत chimeras उपज, १००% आ सकता है, लेकिन आम तौर पर महत्वपूर्ण अतिरिक्त उपकरण (पराबैंगनीकिरण या piezos) और प्रशिक्षण10,11की आवश्यकता है । प्रयोगशालाओं में जहां इन तकनीकों को पहले से ही जगह है, यह नई पद्धति आवश्यक नहीं हो सकता है ।
इस अध्ययन के उद्देश्य के लिए एक तरीका है कि आम तकनीक और आसानी से उपलब्ध उपकरणों का उपयोग करता है कल्पना पीढ़ी की दर बढ़ाने के लिए, उत्परिवर्ती एलील के germline संचरण का मौका बढ़ाने के बाद माउस कॉलोनी की स्थापना की थी ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह लंबे समय सोचा गया है कि आईसीएम के किसी भी गड़बड़ी मृत्युदर को जन्म दे सकता है, वास्तव में, वर्तमान ब्लास्टोसिस्ट microinjection प्रोटोकॉल अभी भी इस12,13की चेतावनी दी । क्या हम यहां दिखाया ग?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अनुसंधान का समर्थन किया गया था [भाग में] NIH, राष्ट्रीय पर्यावरण स्वास्थ्य विज्ञान संस्थान के अंदर अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा । सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए श्यामल Peddada को विशेष धन्यवाद. हम भी इस पांडुलिपि की समीक्षा के लिए Humphrey याओ, गैरी बर्ड, और युकी अराव शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, और अपने निरंतर समर्थन और सलाह के लिए फ्रेंको मेयो ।
Materials
| ES Cell injection needle | Humagen | MSC-20-0 | |
| NSET device | Paratechs | 60010 | |
| DMEM | Gibco (life technologies) | 11965-092 | |
| FBS | Gibco (life technologies) | 10439-024 | lots should be individually tested for ES Cell compatibility. |
| HEPES | Sigma | H0887 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Micro manipulator | Leica | Micro manipulator | |
| micro injector | Eppendorf AG | Cell Tram Air 5176 | |
| Microscope | Leica | DM IRB | |
| 4 well dish | Thermo Scientific | 176740 | |
| 60 mm dish | Sarstedt | 83.3901 | |
| B6(Cg)-Tyr<c-2J>/J | Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA | 000058 | |
| Swiss Webster mice | Taconic, USA | Tac:SW | |
| Injection Dish | MatTek Corp. | P50G-0-30-F |
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