Vi beskrive de skridt, der gør det muligt hurtig in situ prøveudtagning af en lille del af en enkelt celle med høj præcision og minimal invasion ved hjælp af kapillar-baseret mikro-prøvetagning, for at lette kemiske karakterisering af et øjebliksbillede af metaboliske aktivitet i levende embryoner ved hjælp af en specialbygget enkelt celle kapillær elektroforese og massespektrometri platform.
Kvantificering af små molekyler i enkelt celler rejser nye potentialer for bedre at forstå de grundlæggende processer, der ligger bag embryonale udvikling. Aktiver encellede undersøgelser direkte i levende embryoner, nye analytiske tilgange er nødvendige, især dem, der er følsomme, selektiv, kvantitative, robust og skalerbar til forskellige cellestørrelser. Vi præsenterer her, en protokol, der muliggør i situ -analysen af stofskiftet i enkelte celler i frit udvikle embryoner af den sydafrikanske jeg frøen (Xenopus laevis), en kraftfuld model i celle og udviklingsmæssige biologi. Denne fremgangsmåde bruger en kapillær microprobe til Aspirér en defineret del fra enkelt identificerede cellerne i embryonet, forlader naboceller intakt til efterfølgende analyse. De indsamlede celleindhold er analyseret af en individuel kapillær elektroforese electrospray Ionisation (CE-ESI) grænseflade koblet til en høj opløsning tandem massespektrometer. Denne tilgang er skalerbar til forskellige cellestørrelser og kompatible med den komplekse tre-dimensionelle struktur af den embryo under udvikling. Som et eksempel vise vi, at microprobe enkelt celle CE-ESI-MS giver mulighed for belysning af metaboliske celle heterogenitet, der udfolder sig som en stamfader celle giver anledning til efterkommere under udviklingen af fosteret. Udover celle og udviklingsmæssige biologi er de enkelt celle analyse protokoller er beskrevet her indstillet til andre cellestørrelser, celletyper eller dyremodeller.
En omfattende forståelse af embryonale udvikling kræver karakterisering af alle molekylære ændringer, at udfolde sig i hver eneste celle i udviklingslandene organismen. Mens næste Generation Sequencing med molekylær forstærkning giver vides dyb måling af encellede transcriptomes1 i udviklingslandene systemer2,3, betydeligt mindre om suite af mindre molekyler produceret i enkelt embryonale celler, herunder proteiner og, især, metabolitter (molekylmasse < ~ 1.500 Da). Med en hurtig og dynamisk respons på indre og ydre begivenheder fungerer metabolome som en kraftfuld deskriptor af en celle molekylære tilstand. Encellede metabolome, rejser derfor potentiale til at spore den rumlige og tidsmæssige udvikling af celle heterogenitet i de tidlige embryoner og at identificere nye molekyler til funktionelle studier. Dog uden molekylære forstærkning tilgængelige for disse molekyler kræver påvisning af metabolome særlige følsomhed ved hjælp af massespektrometri (MS), som er teknologien valg for metabolitten analyse.
Encellede MS er en samling af teknologier med tilstrækkelig følsomhed til at måle metabolitter i enkelte celler (Se anmeldelser 4,5,6,7,8,9 ,10,11,12,13,14,15). Reproducerbare udtagning af celler og effektiv udvinding af metabolitter er afgørende for vellykket påvisning af metabolitter i enkelte celler. Hele-celle dissektion af identificerede celler fra Xenopus embryoner har aktiveret karakterisering af små molekyler og peptider16. Andre tilgange ansætte Mikropipetter til prøve individuelle levende celler efterfulgt af påvisning ved hjælp af electrospray Ionisation (ESI) MS. For eksempel, blev metabolitter målt i plante eller pattedyrsceller af encellede video MS17, trykbærende prøvetagningssonden18, enkeltsonde19og fluidic force mikroskopi20, blandt andre teknikker21, 22,23,24. Derudover forenkler indarbejdelse af kemisk adskillelse forud for ionisering til én celle MS arbejdsgang effektivt metabolome, dermed afhjælpe eventuelle interferenser under ion generation før registrering. Vigtigere, giver adskillelse også stof-specifikke oplysninger for at hjælpe i molekylær identifikationer. Kapillar elektroforese (CE) er blevet brugt til at registrere metabolitter i enkelt dissekeret25,26 eller microsampled27neuroner, fanger små-molekyle forskelle mellem neuron fænotyper. Vi for nylig tilpasset CE ESI tandem MS hen til muliggøre spor-niveau påvisning af hundredvis af metabolitter i individuelle celler, der blev dissekeret fra tidlige embryoner fra Xenopus laevis16,28. Disse undersøgelser afslørede overraskende metaboliske forskelle mellem embryonale celler på et tidligt udviklingstrin og førte til opdagelsen af metabolitter med tidligere ukendt udviklingsmæssige virkninger16.
Her giver vi en protokol, der aktiverede påvisning af metabolitter i enkelt celler direkte i en levende hvirveldyr embryoner ved hjælp af microprobe encellede CE-ESI-MS29,30. Model organisme valgt er 8-til-32-cellen X. laevis embryo, selv om fremgangsmåde gælder også for senere stadier af udvikling og andre typer af modelorganismer. Denne protokol bruger skærpet kapillærer med multi-akse Translationel kontrol under vejledning af en høj opløsning billedbehandlingssystem til Aspirér en ~ 10 nL del af identificerede celler i situ i det morfologisk komplekse embryo under udvikling. Denne microprobe er skalerbar til mindre celler og opererer inden for sekunder, som er tilstrækkeligt hurtigt til at spore celle lineages i embryo. Efter udpakning polar eller apolar små molekyler, som metabolitter og peptider, fra de indsamlede prøven i ~ 4-5 µL ekstraktionsopløsning, en ~ 10 nL den resulterende ekstrakt er analyseret i en specialbygget CE platform bindestreg til en ESI massespektrometer. Opførelse og drift af CE-ESI-MS platformen bygger på protokoller er beskrevet andetsteds. 31 , 32 den co-axial CE-ESI grænseflade er konstrueret som beskrevet andetsteds. 31 denne platform er fastholdt i kegle-jet sprøjtning regimet til at opnå spor-niveau følsomhed med en kapacitet til kvantificering over en 4-5 log-ordre dynamikområde (relative28,29,30 eller absolutte16). CE-ESI-MS platform tilbyder en 60-Jørgen lavere grænse på opdagelse med 8% Relativ standardafvigelse (RSD) i kvantitering over et afprøvet sortiment af 10 nM til 1 µM for små molekyler16, som er tilstrækkelig til at karakterisere endogene metabolitter i X. Bærmispel celler. Microprobed celler vedbliver med at opdele som embryon skrider frem gennem udvikling30, giver mulighed for tidsmæssigt og rumligt løst analyse af cellulære metabolisme. Faktisk, encellede CE-ESI-MS kan bruges til at finde metaboliske forskelle mellem celler, der besætte dorsal-ventral16,29, dyr-vegetabilsk16, og venstre-højre28 udviklingsmæssige akser samt celler at danne det neurale væv skæbnesvangre dorsal afstamning fra en fælles Stamform celle i X. laevis30. Udover forespørge metaboliske forskelle mellem individuelle embryonale celler på forskellige udviklingsstadier af X. laevis embryo30, forventer vi, at de protokoller, der er beskrevet her kan anvendes til en bred vifte af biomolekyler og enkelt celler microsampled fra forskellige stadier af embryoets udvikling samt andre typer af celler og modelorganismer. Derudover, kunne microprobe anvendes til microsampling, mens en anden platform kompatibel med minimal prøver kan bruges til adskillelse og/eller karakterisering af biomolekyler.
Microprobe CE-ESI-MS giver mulighed for direkte karakterisering af metabolitter i enkelte celler i live, frit udviklingen af embryoner. Kernen i tilgangen er to tekniske delkomponenter, nemlig i situ kapillær microsampling og høj følsomhed CE-ESI-MS. i forhold til hele-celle dissektion, kapillær microsampling har fordelen, at hurtig operation (par sekunder vs 5 min / celle af dissektion), kompatibilitet med den komplekse tredimensionale morfologi af embryoner, og skalerbarhed til mindre celler, der danner i …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af nationale institutter for sundhed tilskud GM114854 (til PN) og CA211635 (til PN), Arnold og Mabel Beckman Foundation Beckman Young Investigator give (PN), DuPont unge Professor award (til PN), American Society for masse Massespektrometri Research Award (til PN) og COSMOS Club Foundation stipendier (til R.M.O. og E.P.P.). Udtalelser og konklusioner udtrykt i denne publikation er udelukkende forfatternes og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af de finansieringskilder.
Reagents for Embryo Culture Media | |||
Potasium chloride | Fisher Scientific | BP 366-1 | |
Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M 65-3 | |
Calcium nitrate | Sigma Aldrich | C1396 | |
Cysteine | MP Biomedicals | 101444 | |
Trizma hydrochloride | Sigma Aldrich | T3253 | |
Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | 5641-212 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Metabolite Extraction Solvents | |||
Acetonitrile (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A955 | |
Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456 | |
Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solvents and Standards for CE-ESI-MS | |||
Formic acid (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A11710X1-AMP | |
Methanol (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
Water (LC-MS-grade) | Fisher Scientific | W6 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | 5641-212 | |
Acetylcholine chloride | Acros Organics | 159170050 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microprobe Fabrication Setup | |||
Micropippette puller | Sutter Instrument Co. | P-1000 | |
Borosilicate capillaries | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | |
Fine sharp forceps: Dumont #5, Biologie/Dumoxel | Fine Science Tools (USA) Inc | 11252-30 | Corrosion resitant and autoclavable. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microprobe Sampling Setup | |||
Micromanipulator | Eppendorf, Hauppauge, NY | TransferMan 4r | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ18 | Should be vibrationally isolated. |
Illuminator e.g. Goosenecks | Nikon | C-FLED2 | |
Microinjector | Warner Instrument, Handem, CT | PLI-100A | |
Transfer pipettes (Plastic, disposable) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
Petri dish 60 mm and 80 mm | Fisher Scientific | S08184 | |
Glass Pasteur Pipets ( Borosilicate, disposable) | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
Centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend X1R | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
CE-ESI-MS Setup | |||
High voltage power supply | Spellman | CZE1000R | The HVPS may be controlled remotely using a low-voltage program generated by a personal computer. Caution: High voltage presents electrical shock hazard; all connective parts must be grounded or carefully shielded to prevent users from accidental exposure. |
Syringe pumps (2) | Harvard Apparatus | 704506 | |
Stereomicroscope | Amscope | SM-3BZZ | Stereomicroscope capable of 4.5× magnification, equipped with an illuminator to monitor the spraying mode of the CE-ESI interface. |
XYZ translation stage | Thorlabs | PT3 | |
XYZ translation stage | Custom-built | This platform is capable of loading nanoliter-amounts of sample into the separation capillary via hydrodynamic injection and supplying the BGE for CE. Both interfaces described in this work were able to inject 6–10 nL of sample within 1 min into a 1 m separation capillary | |
Stainless steel sample vials | Custom-built | ||
Stainless steel BGE vial | Custom-built | ||
Fused silica capillary (40 µm/105 µm ID/OD; 100 cm) | Polymicro technologies | TSP040105 | |
Fused silica capillary (75 µm/360 µm ID/OD; 100 cm) | Polymicro technologies | TSP075375 | |
Stainless steel emitter with blunt tips (130/260 µm ID/OD) | Hamilton Co. | 21031A | For better performance, laser-cleave and fine-polish the emitter tip. |
Syringes (gas-tight): 500 – 1000 µL | Hamilton Co. | 1750TTL | |
Digital multimeter | Fluke | Fluke 117 | |
High-resolution Mass Spectrometer | Bruker Daltonics | Maxis Impact HD | High-resolution tandem mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure interface configured for ESI |
Tunning mixture for mass spectrometer calibration | Agilent technologies | ESI-L G1969-85000 | |
Data Analysis ver. 4.3 software | Bruker Daltonics | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ancillary Equipment | |||
Vacuum concentrator capable of operation at 4–10°C | Labconco | 7310022 | |
Analytical microbalance (XSE105DU) | Fisher Scientific | 01911005 | |
Freezer (-20 °C) | Fisher Scientific | 97-926-1 | |
Freezer (-80 °C) | Fisher Scientific | 88300ASP | |
Refrigerated Incubator | Fisher Scientific | 11475126 | |
Vortex-mixer | Benchmark | BS-VM-1000 |