Большая площадь сканирования зонд нанолитографию способствовало автоматического выравнивания и его применение для изготовления подложки для изучения культуры клеток

Summary

Здесь мы представляем протокол для обширной территории сканирования зонд кантилеверных включена путем итеративного выравнивание зонд массивов, а также использования литографических моделей для исследования взаимодействия клетк поверхности.

Abstract

Сканирующая зондовая микроскопия позволяет создание различных методов для конструктивного изготовления (присадки) сверху вниз нанометровом масштабе функций. Исторически, основным недостатком сканирующего зонда литографии неразрывно низкую пропускную способность систем одного датчика. Это может быть решена путем использования массивов несколько зондов для включения кантилеверных увеличение пропускной способности. Для реализации такого параллельного нанолитографию, точное выравнивание зонд массивов с поверхности субстрата является жизненно важным, таким образом, чтобы сделать все датчики контакта с поверхностью одновременно, когда начинается литографических кучность. Этот протокол описывает использование полимерных перо литографии производить нанометровом масштабе функции над сантиметр размера районов, облегчается использование алгоритма для быстрого, точного и автоматизированных выравнивание зонд массивы. Здесь нанолитографию тиолы на золото субстратов демонстрирует поколения функций с высокой однородности. Эти шаблоны затем функционализированных с фибронектин для использования в контексте исследований по морфологии ориентированные на поверхности клеток.

Introduction

Прогресс в области нанотехнологий зависит от разработки методов, способных эффективно и надежно изготовления наноразмерных компонентов на поверхностях. ^{1 , 2} однако, создавая такие особенности на больших площадях (несколько см²) надежно и на относительно низкая стоимость нетривиальных усилий. Большинство существующих методов, производный от полупроводниковой промышленности, полагаются на абляционного фотолитографии для изготовления «твердый» материалов. Совсем недавно литографический методы, производные от сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ) появились как удобный и универсальный подход для быстрого прототипирования наноразмерных конструкций. ³ методы, основанные на РП возможность удобно и быстро «писать» любой шаблон, определяемые пользователем. Наиболее известным из них является dip Пен нанолитографию (ДПН), впервые Миркин et al.,⁴ где сканирующего зонда используется как «перо» для передачи молекулярной «чернила» на поверхности особенности в моде, аналогичные письма. При температуре окружающей среды, как зонд проверяется по всей поверхности молекулы «чернила» передаются поверхности через воды мениска, который формирует между зондом и поверхностью (рис. 1). DPN таким образом позволяет nanolithographic осаждения широкий спектр материалов, в том числе «мягкие» таких полимеров и биомолекул. ⁵ Родственные методы, с помощью зондов, инженерии с каналами для доставки жидкости, различно называется «nanopipettes» и «nano-авторучки», также поступало. ^{6 , 7 , 8}

Главным препятствием для более широкого применения СПР производные литографии является пропускная способность, как это требует слишком много времени в шаблон сантиметр масштаба районы с единичного пробоотборника. Ранние усилия для решения этой проблемы сосредоточены на распараллеливания основанных на консольные ДПН, с «одно-мерного» и «двумерные» (2D) зонд массивы, сообщанными для литографии сантиметр размера областей. ^{5 , 9} однако эти массивы консольные производятся через сравнительно сложный многоэтапный изготовление методы и относительно слабы. Изобретение полимера перо литография (PPL) рассматривала этот вопрос путем замены стандартных кантилеверов СЗМ с массивом 2D мягкой силоксановых эластомер зондов, приклеенная к слайду стекла. ¹⁰ этот простой датчик установки значительно снижает стоимость и сложность структурирования больших площадей, открытие кантилеверных для более широкого круга приложений. Эта консольно бесплатные архитектура также была расширена жесткий отзыв пружину литографии,¹¹ , которая обеспечивает гибрид мягких эластичных минусовки с жесткий кремния советы, давая более резолюции по сравнению с шаблонов производится с помощью мягкой эластомер советы.

Решающим фактором в реализации этих технологий двумерный массив является, что зонд массив должен быть точно параллельна поверхности субстрата так, что когда литографии используется, все датчики соприкасаться с поверхностью одновременно. Даже небольшой перекос может привести к большой разницы в размере функция с одной стороны массива на другой, так как некоторые датчики будут контактировать поверхность ранее во время спуска массива, в то время как другие вступит в контакт позже или не на всех. ¹² точное выравнивание особенно важна с PPL благодаря деформируемость мягкая эластичная зондов, где будут сжаты зонды, связавшись с поверхности ранее, оставляя больше след на поверхности.

Ранние работы на PPL работают чисто визуальный осмотр направлять процесс выравнивания, с помощью камеры, установленной выше массив наблюдать деформации пирамидальной зондов, как они были принесены контакт с поверхностью. ¹⁰ выравнивание судил наблюдения, какой стороне зондов соприкоснулся с поверхности сначала, то Регулировка угла и повторяя процедуру на постоянной основе до тех пор, пока разница в контакт на каждой стороне зонда неразличимы глазом. Поскольку эта процедура выравнивания зависит от субъективных визуальный осмотр оператором, воспроизводимость является низким.

Впоследствии был разработан более объективный подход, состоящий из сил Датчик монтируется под субстрат для измерения силы, применяется при контакте зондов на поверхности. ¹² выравнивание таким образом было достигнуто путем регулировки углов наклона максимизировать сила, которые сообщили, что все датчики одновременно в контакте. Этот метод показал, что выравнивание для 0,004 ° параллельно поверхности возможно. Это «сила обратной связи выравнивание» теперь реализована в полностью автоматизированных систем в двух независимых докладах. ^{13 , 14} как использовать триады датчиков силы монтируется под субстрат или выше массив и измерить количество силы оказываемого на контакт между массивами зонда и поверхностью. Эти системы дают высокой точности, отчетности некоаксиальности ≤0.001 ° на 1 см Длина шкалы,¹⁴ или ≤ 0,0003 ° над 1.4 см.¹³ эти автоматизированные выравнивание системы также обеспечивают крупные сбережения в времени оператора и общее время, требуемое для завершения литография процесса.

Один из основных применение высок объём поверхности этой технологии изготовления это поколение субстратов культуры клеток. Сейчас хорошо известно, что фенотип ячейки можно манипулировать, контролируя первоначального взаимодействия между клетками и особенности поверхности, и что это может быть повышена на наноуровне. ¹⁵ специально, зонд литографии методы как доказано быть поверхностным методом для производства различных поверхностей nanofabricated для таких экспериментов культуры клеток. ¹⁶ например, поверхности, представляя наноразмерных структур собственн-собранные монослои и внеклеточного матрикса, белки шаблонного PPL и DPN были использованы для изучения потенциала нано модифицированных материалов в материале индуцированной дифференциация Стволовые клетки. ¹⁷

Этот протокол описывает использование модифицированных атомно-силового микроскопа (AFM) системы, которая позволяет большой площади PPL. Мы подробно определение силы, используя множественные датчики силы в качестве средства определения зонд поверхности контакта, используя алгоритм, который автоматизирует процесс последовательной выравнивания. Последующие функционализации этих шаблонов с фибронектин белков внеклеточного матрикса и культуры мезенхимальных стволовых клеток (МСК) описаны, как проявление PPL-готовых поверхностей, применяется для клеточной культуры.

Protocol

1. Изготовление PPL перо массива

1. Подготовить смесь сополимер полидиметилсилоксан (PDMS):
   1. 10 мкл платины (0) - 1,3 - дивинила-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane комплексное решение и 172 мкл 1,3,5,7-тетраметилсвинца-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane до 250 g (7-8% w/w vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane Кополимер. Смешайте эти компоненты тщательно на роторный смеситель для 7 дней для обеспечения однородного смешивания.
      Предупреждение: платина (0) - 1,3 - дивинила-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane является токсичным. Пожалуйста, прочитайте MSDS перед началом работы с этим решением. Оборудование безопасности должны носить при обработке данного химического вещества.
   2. Добавить 0,5 г (25-35% w/w methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane Кополимер 1.7 g части смеси из шага 1.1.1 в весом катера и тщательно перемешать шпателем.
   3. Дега этой смеси путем передачи его в вакуум-сушильный шкаф и подвергая смесь до низкого давления (200 mTorr, 0.3 мбар) за 20 мин до тех пор, пока все пузырьки газа рассеялись.
2. 13 x 13 мм стекла слайд в пластиковом флаконе винт превысила заполнены с 20 мл 2-пропанол, затем место флакона в ультразвуковой ванне для 10 мин для удаления любых крупных мусора. Вымойте слайды, погрузив слайды в свежий 2-пропанол (100 мл) и высушить под струей газа азота.
3. Место кремния мастер¹⁸ в чашку Петри диаметром 4 см и добавить достаточно дегазацию PDMS предполимер смесь (из шага 1.1) до полностью покрыты. Как правило 100 мкл требуется для мастер 20 x 20 мм. Место мастер с предполимер смеси в вакуума помещаются в эксикатор. Дега полимер для еще 5 мин для удаления любой пузырьки газа, образующихся при передаче смеси. O₂ Плазменная обработка стекла слайдов (шаг 1.4 ниже) должны выполняться в то время как проходит дегазации.
4. Лечить стекла квадраты с O₂ плазмы (600 mTorr) при максимальной мощности RF 1 мин для удаления любого органического загрязнения и для создания единообразных окиси слой на стекло для адгезии эластомера. ¹⁹ использование плазмы лечить слайды сразу на следующем шаге.
5. Осторожно поместите квадратных стеклянное скольжение (из шага 1.4) над форполимера на образце (от шага 1.3) с плазменной очистки лицевой стороной вниз. Аккуратно прижмите стеклянное скольжение на кремний мастер удаления любых захваченного воздуха и обеспечить равномерную пленку PDMS зажата между капитаном и слайд.
6. Место слоеное PDMS массив сверху шаг в чашке Петри с кремнием мастер в нижней (т.е., с задней частью стеклянное скольжение вверх) и поместите блюдо в духовке при 70−80 ° C для 24−48 h термически вылечить PDMS.
7. Удаление вылечить массив из духовки и позволяют крутые 15 мин, затем с лезвием бритвы тщательно удалить любой избыток PDMS со спины и стороны стекла слайд и использовать поток сухого азота для сдуть любой мусор PDMS.
   Примечание: Будьте осторожны не нуля кремния мастер с лезвием, как это может повредить антипригарное покрытие.
8. Клин лезвием бритвы в угол массива на глубине 1 мм и тщательно подглядывать массив отдельно от мастера. Выполнить это действие в одной непрерывной подъема действий; не позволяйте массивы падать обратно на master.
9. Тщательно вырезать и отчищать 0,5 мм PDMS на краях массива с лезвием бритвы. Использование потока сухого азота чтобы сдуть любой мусор PDMS.
   Примечание: Это может быть легче выполнять этот шаг обрезки под стереоскоп или увеличительное стекло. Будьте осторожны не нуля кремния мастер с лезвием, как это может повредить антипригарное покрытие.

2. массив подготовки и монтажа субстрата

1. Создайте гидрофильные поверхности на массиве зонд, O₂ плазменной очистки:
   1. Место массива перо PPL в чашке Петри в плазме камеру, а затем применять вакуум 600 mTorr. Переключение на плазменный генератор (максимальное значение) для 30 s.
   2. Отпустите вакуум, удалить массив и проверьте ее гидрофильность, удалив 20 мкл деионизованной воды на массив и наблюдения, есть ли даже распространение воды по всей поверхности. Если этого не происходит, подлежащих второй раунд плазменной обработки массива. После этого сухой массив тщательно с потоком газа сухим азотом.
2. С помощью ленты двухсторонний углерода, присоедините массив на середине держателя зонд. Прикрепите держатель зонда на AFM кинематической держатель (рис. 2).
3. Чтобы загрузить массив PPL с 16-mercaptohexadecanoic кислоты (МГА) («красочных»):
   1. Подготовьте раствор 1 мм 16-mercaptohexadecanoic кислоты (МГА), растворяя 8,6 мг в 30 мл этанола в трубку и поместив его в ультразвуковой ванне за 10 минут, чтобы полностью растворить соединения.
      Предупреждение: 16-mercaptohexadecanoic кислота является токсичным. Пожалуйста, прочитайте MSDS перед началом работы с этим решением. Оборудование безопасности должны носить при обработке данного химического вещества.
   2. С помощью микропипеткой, депозит 20 мкл капля раствора МГА в массиве. Избегайте контакта наконечники с массивами. Позвольте ему распространяться во всем массиве, а затем позволить этанола испаряется при температуре окружающей среды.
      Примечание: PPL массив в качестве альтернативы может быть подписан после того, как произошло выравнивание. ¹⁰
4. После высыхания раствора МГА, смонтируйте держатель зонда с PPL массива на AFM.

3. Подготовка золота субстратов для PPL.

1. Золото субстратов могут либо приобрести, или изготовить доме тепловой или электронно пучка осаждения и построены 2 Нм Титан адгезии слоя следуют 20 Нм золота на стекло или кремниевой пластины. ¹⁸
2. При необходимости, очистите субстратов кислорода плазменной обработки с помощью параметров, описанных в шаге 1.4.
3. Место золотой субстрата в середине этапа образца AFM и зафиксируйте с липкой лентой вокруг границ субстрата (рис. 2). Настроить сцену в правильной высоте, как указано в инструкции по эксплуатации изготовителя, с использованием z-оси контроллера.

4. Автоматическое выравнивание массива пера

1. Открыть и запустить контроллер этап программы установки (SetupNSF.exe) на компьютере, чтобы сбросить («ноль») всех осей и углов для предварительно откалиброванные нулевой точки, а затем использовать этап x/y-оси контроллера консоли для перемещения субстрат необходимое выравнивание / Печать расположение. Для получения оптимальных результатов субстрат должен располагаться в центре сцены, между стадии силы датчики.
   Примечание: В некоторых моделях компьютера, x/y-оси контроллера USB сигнал помехи, что от z-оси контроллера. Если это произойдет, отсоедините x/y-оси контроллера USB кабель после этого шага. Он должен затем переподключить после процедуры выравнивания (шаг 4.7).
2. Переключите рычаг стадии освободить стадии образца и активировать триады датчиков силы, как указано в инструкции производителя AFM. Разрешить датчики силы сбалансировать по крайней мере 15 минут. Для получения оптимальных результатов позволяют 30-50 мин.
3. Увеличьте высоту по оси z для приведения массива в непосредственной близости с подложкой, визуально наблюдая массив зонда и поверхностью.
   Примечание: Чем ближе массив на поверхность, меньшее количество итераций необходимы для процесса выравнивания, тем самым экономя время.
4. Открытие/запуск программы автоматического выравнивания (автоматическое выравнивание v16.exe) и введите параметры соответствующих выравнивание в программу.
   1. Введите значение параметра желаемого «угол шаг», обычно 0,15 °. Этот параметр является угол смещения от «оптимальной» угол для каждой оси, которая определяется программой. Установите для этого параметра между 0,1 и 0,2 °, как углы, ниже, чем этот диапазон не приводит к явно обнаруживаемая силы разница на подходе зондов на поверхности.
      Примечание: Программное обеспечение принимает значения в millidegrees (т.е., 1 x 10^-3 °). Например на 0,15 °, пользователи должны вводить '150».
   2. Ввод желаемой грубая Шаг ' значение параметра, обычно 0,6 мкм. Этот параметр является размер шага по оси z, используется на сцене, как она приближается зондов в первоначальное предварительное выравнивание. Установите для этого параметра между 0,2 и 1 µm. больше шаг размеров уменьшение времени, необходимого для процесса выравнивания, но уменьшить точность выравнивания и увеличить износ зондов.
      Примечание: Программное обеспечение принимает значения грубый шаги в микрометрах. К примеру 0,6 мкм пользователи должны input «0.6'.
   3. Введите нужное значение параметра «Прекрасный шаг», обычно 0,2 мкм. Этот параметр является размер шага по оси z используется для тонкой настройки оптимального выравнивания. Для большинства приложений установите для этого параметра между 0.1 и 0,4 мкм. большие значение шаг размеры будет уменьшить количество времени, требуемое для процесса выравнивания, но снижают качество выравнивания.
      Примечание: Программное обеспечение принимает значения тонкой шагов в микрометрах. Например для 0,2 мкм, пользователи должны вводить «0.2.»
   4. Настройка «путь к файлу Excel» и прикрепить неизмененной копию файла шаблона предоставленную таблицу, используя значок «папка», перейти к расположению файлов и нажмите «OK». Этот файл содержит необработанных и вычисляемых данных, которая используется для определения углов наклона оптимальный стадии этапа.
5. Открытие/запуск программного обеспечения управления AFM. Перейдите к спектроскопии компонент этой программы, нажав кнопку «спектроскопии» (согласно инструкциям производителя) и установите AFM сканирования головы z-axis колебаться от 10 мкм свыше 100 мс, время паузы 250 мс, затем отказаться 10 мкм более 100 мс время паузы 250 мс (рис. 3).
6. Осциллирующие головку AFM, нажмите кнопку «Пуск» выравнивание программного обеспечения, чтобы начать процесс автоматического выравнивания. Когда программа запущена, программное обеспечение записи и чтения данных в файл, описанный в шаге 4.4.4.
   Примечание: Выравнивание занимает от 30 минут до 3 ч в зависимости от начальной стадии позиции в шаге 4.3 и конфигурации программного обеспечения, которые были введены в шаге 4.4.
   Предупреждение: Этап контроллера консоли по-прежнему активны во время процесса выравнивания - не использовать их в процессе выравнивания, как он будет вмешиваться с выравниванием.
7. По завершении выравнивание будет горит зеленый свет поле «Выравнивание завершены» выравнивание программного обеспечения (от шага 4.4). Когда это происходит, нажмите кнопку «STOP» на интерфейсе пользователя прекратить процесс выравнивания.
8. Осмотрите графики в файл шаблона таблицы для корреляции между записанных данных точки и линии подходят, генерируемые программным обеспечением. Представитель результаты для примеров хорошей корреляции, типичные значения² R > 0,99. Если выравнивание не удается, замените массив зонд свежеподготовленные массив (шаг 2) и повторить выравнивание (шаг 4.4).
9. Переместить стадии вверх в z-оси, с помощью консоли контроллера этап для этой оси. Стадии следует перенести в 500 Нм с шагом до тех пор, пока контакт можно наблюдать от вид сверху камеры AFM. Контакт между массивом и субстрат можно наблюдать как «белая точка» высокой контрастности на вершине пирамиды отдельных зонд.
10. На данный момент нажмите кнопку «Остановить» на программное обеспечение управления AFM остановить программу спектроскопии с шагом 4.5. Это будет отзывать массив 10 мкм, таким образом оставляя 10 мкм расширение возможных z-axis. Проверьте изображение от камеры вид сверху AFM для обеспечения что зонды не соприкасаются с подложкой.

5. полимерные перо литография (PPL)

1. Перейдите к компоненту литографии программного обеспечения управления, нажав кнопку «литографии» на программное обеспечение управления. Выберите z-модуляция режим работы и импортировать растровые (растровое изображение) или векторное изображение, которое будет использоваться как шаблон литографии. Чтобы создать функции, приведенные в представительных результатов, используйте растровое изображение состоящее 20 x 20 черных пикселей (см. Дополнительные материалы), соответствующий литографии сетку 20 x 20 точек на зонд на массиве PPL.
2. Введите параметры литографии в окно «Пикселей графики импорт» программного обеспечения контроллера AFM.
   1. Настройка «Размер» шаблон будет создан, например, 40 мкм в длину и ширину. Эти параметры указывают ширину и длину, над которым будет масштабировать изображение в растровом изображении. Для создания функций, представленных в результатах представительных, используйте ширину и длину 40 мкм в обоих измерениях.
   2. Установите происхождение шаблон будет создан в 25 мкм на оси x и y . Эти параметры определяют центр изображения относительно центра AFM x/y-оси. Задайте эти параметры, чтобы избежать региона поверхности где датчики были в контакте во время процесса выравнивания.
   3. Задайте печать «Параметры». Эти значения определяют, как датчики должны быть продлен (т.е. принес контакт с поверхностью) в ответ на каждый пиксель в растровое изображение.
      1. Выберите из раскрывающегося меню «Модуляции Abs Pos Z» и «Упростить, чтобы» два слоя. Этот режим дает AFM продлить зонды, абсолютное расстояние, определяется только два результата, «Черный (0)» или «Белый (1)» поля.
      2. Задайте значения в полях «Белый (1)» и «Черный (0)» 5 и -5 мкм, соответственно. Эти значения определяют расстояние, датчики должны быть перемещены в ответ на черный или белый пиксель на растрового изображения и обычно заданы между 3 и 5 мкм для «Черный» (т.е., расширить зонды вниз, что расстояние относительно нулевой точки этой оси) и -3-5 мкм для «Белый» (то есть, снять зонды вверх по 3-5 мкм относительно нулевой точки).
         Примечание: Эти представительные расстояния предположить, что расширение 5 мкм приводит зонды, соприкасаясь с поверхностью и следовательно поколения функцию, хотя вывод 5 мкм поднимает зондов от поверхности привело никаких контактов. Z-расширение влияет на размер функция определения степени зонд контакта с поверхности, больше расширений результат в зонды, отжиманным далее на поверхности, что приводит к большей возможности. ¹⁰
      3. Нажмите кнопку «OK», чтобы реализовать эти настройки и закрыть окно.
3. Введите время задержки в окне литографии AFM управления программного обеспечения, как правило 1 s. Этот параметр определяет продолжительность времени, зонды, остаются в выдвинутом положении «Черный», который обычно устанавливается между 0,1 и 10 сек.
   Примечание: Время паузы привести больших размеров компонентов из-за большего количества МГА, транспортируется на поверхность золота. Более подробная информация о Управление размером функций созданных можно найти в других докладах. ²⁰
4. Подготовьте корпус атмосферного контроля.
   1. Нижняя палата атмосферных изоляции на AFM и открытие/запуск программное обеспечение поставляемые изготовителем атмосферного контроля (MHG_control.exe).
   2. Установите программное обеспечение атмосферы управления для поддержания относительной влажности 45%, температура 25 ° C и атмосферы обмена «Поток» 500 мл, введя значения в программное обеспечение. Нажмите кнопку «Использовать», для внедрения параметров. Затем модуль атмосферного контроля начнут насос увлажненный воздух в камеру.
      Примечание: Высокий уровень влажности приводят в больших размерах функцию за счет формирования больших воды мениска, созданные между массивами пера и поверхностью. ²¹ это значение обычно устанавливается между 40 и 60%. Скорость потока обычно устанавливается между 300 и 500 мл. Большие потоки позволяют уровень желаемой влажности более быстрыми темпами достичь, но менее точной. Представитель результаты использовать скорость потока 500 мл для первоначального создания влажности и уменьшается до 300 мл после достижения желаемой влажности, для поддержания точной и стабильный уровень в литографии.
5. Получив нужную влажность, начните литографических последовательности, нажав на кнопку «Пуск» на интерфейс программного обеспечения.
6. По завершении литографии используйте консоль контроллера стадии оси z для перемещения субстрата от массива путем втягивания стадии 500 мкм. Затем удалите зале атмосферных изоляции от его крепления.
7. Переключить стадии рычаг блокировки стадии образца и отключить датчики силы, как указано в инструкции производителя AFM, а затем удалите подложку из стадии.

6. шаблон визуализации

1. Шаблоны могут быть визуализированы с помощью одного из следующих методов, боковые силы, сканирование зонд микроскопии или химического травления.
2. Сканирование поверхности рисунком на AFM с боковой силы режиме, используя режим контакта консольные для изучения особенностей неразрушающее.
   Примечание: Боковые силовой микроскопии может использоваться как неразрушающий метод просмотра особенностей производства полимерной перо литографии; Однако с помощью этого метода, лишь сравнительно небольшую площадь может быть визуализирован (обычно 100 x 100 мкм).
3. Поскольку хранение МГА может выступать в качестве etch сопротивляться, химическое травление может использоваться для удаления золото из районов узорные. Результате реставрацию с помощью временного области затем могут быть визуализированы на оптической микроскопии, означает, что широкий район может рассматриваться одновременно. ¹⁸
   Примечание: Субстраты, которые запечатлелись в таким образом тогда не может использоваться для последующих клетки культуры эксперименты, описанные ниже.
   1. Отдельно Подготовьте водные растворы 40 мм тиомочевины, нитрат iron(III) 27 мм и 100 мм соляной кислоты. Подготовка etchant путем смешивания 5 мл каждого из этих трех решений. Свежую смесь перед каждым использованием. ²²
      Предупреждение: Тиомочевина, iron(III) нитрат и соляной кислоты являются токсичными. Пожалуйста, прочитайте MSDS перед началом работы с этим решением. Оборудование безопасности должны носить при обработке данного химического вещества.
   2. Передача узорной субстрата в чашку Петри и пипетки достаточно протравливающего решение в блюдо для покрытия поверхности субстрата (обычно 10 мл). Держать субстрат, погружения на 4-5 мин до etch 15 Нм золота (скоростью приблизительно 3 Нм/мин).
   3. Когда завершена травления, удалите подложку и тщательно промыть водой и сухой с потоком азота.
      Примечание: Завершение процесс травления определяется толщина поверхности золота получены (шаг 3.1) связанные с травлением курсу, указанному (шаг 6.2.2).
   4. Проверьте функции травлению золото под светлые области оптической микроскопии. Оставшиеся золото функций, которые остаются должен появиться соответствующий шаблону, который был напечатан (из шага 5.2). Если вся поверхность однородной, это означает, что остается значительное количество золота и травления шаг (следующий шаг 6.2.2) должны быть повторены для 1-2 мин.

7. образец функционализация фибронектин

1. Погружать узорной субстратов в раствор 1 мм (11-mercaptoundecyl) hexa(ethylene glycol) раствора в этанол на 1 ч. мыть субстрат три раза с этанолом и высушить под струей азота. Этот шаг пассивировать неупорядоченный золото области.
   Предупреждение: hexa(ethylene glycol) (11-mercaptoundecyl) является токсичным. Пожалуйста, прочитайте MSDS перед началом работы с этим решением. Оборудование безопасности должны носить при обработке данного химического вещества.
2. Опускайте субстратов в 10 мм₂ Co (№₃) водный раствор на 5 мин. Далее удалите подложек из раствора, промойте в три раза с ультрачистая вода и сухой под струей сухого азота.
   Предупреждение: Co (№₃)₂ является токсичным. Пожалуйста, прочитайте MSDS перед началом работы с этим решением. Оборудование безопасности должны носить при обработке данного химического вещества.
3. Погружать субстрата в 50 мкг/мл раствора фибронектин в-фосфатный буфер (PBS) и Инкубируйте на 4 ° C для 16 h. мыть субстрат три раза с PBS, а затем сухой субстрат под струей сухого азота.
   Примечание: Фибронектин привязан к МГА функционализированных районы через комплексообразования Co(II) терминала карбоновые кислоты группами на МГА. Фибронектин затем привязывается к Co(II) через его коллагена связывающий домен. ²³
4. При желании, визуализируйте поверхности прыгните фибронектин, маркировки с флуоресцентные антитела:
   1. Применять 2 мл раствора 1: 100 неконъюгированной кролик анти фибронектин основное антитело в 5% (w/v) бычьим сывороточным альбумином (БСА) в PBS на поверхность и Инкубируйте на 4 ° C для 16 h. аспирата супернатант и стирать три раза с PBS.
   2. Опускайте субстрата в 2 мл раствора дневно конъюгированных вторичные антитела анти кролик (на производителя указанного разрежения, 2 капли/мл) в 5% (w/v) BSA в PBS, охватывают в фольгу олова и инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч. аспирационная супернатант и мыть три раза с PBS.
   3. Запись эпифлуоресцентного микроскопии изображений функций, с помощью микроскопа флуоресценции согласно инструкциям производителя, с фильтром возбуждения присвоено 594 Нм.

8. клеточной культуры на nanofabricated поверхностях

1. Подготовьте подвеска хорошо характеризуется использования, которые находятся между 4-^й и 6-^й проход. ²⁴
   1. Приостановить вырожденная колбу клеток, промыв раз с 10 мл PBS, отделить придерживался клетки, добавив 5 мл трипсина/ЭДТА в колбу T75 культуры ткани и инкубировать колбу в камере увлажненной при 37 ° C, дополнена 5% CO₂ до 5 минут до 90% o f клетки отсоединяются от поверхности.
   2. Впоследствии добавить 6 мл свежего культуральных сред, содержащие 10% плода телячьей сыворотки (FCS) в колбу и кратко промойте колбу с добавил СМИ. Перевести суспензию клеток в 15 мл центрифуги и центрифуги на 400 g при 25 ° C за 5 мин.
   3. Удалить супернатант и Ресуспензируйте Пелле клеток в 3 мл свежего культуры средств массовой информации.
   4. Граф плотность клеток с помощью Горяева²⁵ и регулировка плотности суспензии клеток до 2 х 10⁴ клеток/мл путем добавления соответствующего объема культуры средств массовой информации.
2. Семя клетки на субстраты на плотность 10⁴ клетки/см².
   1. Нарезать 1 x 1 см² с алмазной писец субстрата и поместите его в колодец в пластине 12-ну тканевые культуры.
   2. Пипетка 2 мл суспензии клеток в культуре средств массовой информации (от шага 8.1.4) в колодец и инкубировать в камере увлажненной при 37 ° C, с 5% CO₂ на 24 часа.
3. После роста клеток на шаблоны анализировать степень привязанности клеток и распространение иммунофлюоресценции:
   1. Извлеките носитель и мыть субстратов с PBS. Исправить клетки с 2 мл раствора параформальдегида 4% в PBS (предварительно разогретую до 37 ° C) для 20 мин в зонта и мыть три раза с PBS.
      Предупреждение: Параформальдегида является токсичным. Пожалуйста, прочитайте MSDS перед началом работы с этим решением. Оборудование безопасности должны носить при обработке данного химического вещества.
   2. Разрушения клеток с 2 мл раствора 0,5% моющего средства (см. Таблицу материалы) в PBS на 15 мин, затем смывают три раза с PBS.
   3. Погружать субстрата в 2 мл раствора первичного антитела анти фибронектин неконъюгированной кролика в разведении 1: 100 с 5% (w/v) BSA в PBS и Инкубируйте на 4 ° C для 16 h, а затем вымыть три раза с 0,1% (v/v) 20 анимации в PBS (PBST).
   4. Впоследствии погружать субстрата в 2 мл раствора дневно конъюгированных анти кролик вторичные антитела (разбавляют 5% (w/v) BSA в PBS на производителя указанного разрежения, 2 капли/мл), охватывают в фольгу олова и инкубации при комнатной температуре в течение 1 ч, затем вымойте три раза с 0,1% PBST.
   5. Маркировать филаментов актина, погружать 2 мл дневно конъюгированных Фаллоидин при разбавлении 1: 250 в PBS, покрытия в фольгу олова и Инкубируйте на 4 ° C на 30 мин, затем мыть три раза с PBS.
   6. Одновременно пятно клеточных ядер и смонтировать подложке путем нанесения капли монтажа средних содержащие DAPI и крышка с coverslip.
4. Визуализировать клетки под микроскопом флуоресценции согласно инструкциям производителя, с фильтрами возбуждения 365 Нм для ядер (DAPI), 488 нм для F-актина и 594 Нм для фибронектин.

Results

Чтобы проверить, было ли успешным автоматического выравнивания, были рассмотрены графики построены из выравнивание данных (в таблице из шага 4.8). Там, где процесс выравнивания были успешными двух участков, соответствующий угол, в котором стадии образца была наклонена вдоль осей θ и φ, показали серию растет и по убыванию точек данных. В каждом из участков, два линейных подходит точек данных показал четко пересекаются «пик», показывающее максимальное z-расширение и соответствующий угол, на котором выравнивание было достигнуто (рис. 4A и 4B). Этот процесс является неоднократные четыре раза (т.е., дважды для каждой оси) и как набор четырех координат. Таким образом, пересечением каждой пары координат показывает целом оптимальных углов (рис. 4 c). ¹³ в тех случаях, когда выравнивание не был успешным, он может наблюдаться что их соответствующих θ и φ угол участки не дают хорошего качества линейные посадки, или не пересекаются (рис. 5). Такой сбой рядов, как правило, в результате массивы неправильно обрезать или монтируется держатель зонда (шаги 1.7, 1.8 и 2.2). В этих случаях массивы были удалены и один новый подготовленный и смонтированы (шаги 1 и 2), и процесс выравнивания повторяется (шаг 4).

После успешного согласования и литографии с МГА закона о госзакупках рисунком золото субстратов были затем образы с помощью микроскопии боковое усилие для изучения ли осаждения имели место. Большие области экспертизы печатной поверхности вел оптической микроскопии субстратов после травления золота, не защищены на хранение тиоловых (Рисунок 6 и рис. 7). Однако травлению шаблоны не могут использоваться для дальнейшего функционализации и должен использоваться только для подтверждения кучность на репрезентативных выборок партии печатной поверхности субстратов. Если травлению шаблоны пустых областей, соответствующих отдельным ручки (рис. 8), этот результат указывает, что производство зонд массивов не было успешно сделано, и что некоторые зонды повреждены или отсутствуют. Эта неоднородность зондов может быть за счет использования старых мастеров, где покрытие перфторированные стерлась (шаг 1.3), что привело в некоторых пробах раздирают прочь когда массив отделена от мастера. В этих случаях следует использовать новый мастер. Результат может также объясняться присутствие воздушных пузырьков в ловушке между стеклом бэк и мастер (шаг 1.5), или если массив зонд был не разделить от мастера после отверждения (шаг 1,8).

Флуоресцентными микроскопии изображения поверхностей фибронектин функционализированных инкубирован использования были также собраны (рис. 9). В общем все субстраты были стабильными в среде культуры в пробирке и клетки придерживался и адаптировать их морфология напечатанные картины в случае небольших изолированных 20 x 20 массив функций.

Рисунок 1. Схематическое представление полимера перо литографии показаны молекулярной чернила транспорта через воды мениска на кончике зонда. (A) вид сбоку и (B) сверху массива перо полимер указывают, что когда зонд массив и поверхности субстрата полностью выровнены, все датчики контактируют поверхность одновременно, результате распараллеленное литографии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Принципиальная схема литография пером полимера установить вверх (A) расширение сбоку экспериментальной установки где подготовленные зонд массив прилагается держатель зонда и монтируется на AFM сканера. Субстрат помещается на сцене, ниже которой расположены три силы датчики. (B) представление собранных приборостроение, показаны AFM сканирования головы по отношению к стадии образца. (C) снизу вид расположения датчика силы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3. Схематическое изображение изображением спектроскопии программа для процедуры выравнивания. AFM сканер установлен для перемещения преобразователей сторону образца на расстоянии 10 мкм в пределах 100 мс, состоявшейся в позиции для 250 мс, следуют Ретракция 10 мкм в течение 100 мс, а затем провела для 250 мс в задвинутом положении. Затем движение повторяется на протяжении всего процесса выравнивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4. Графики, иллюстрирующие успешные выравнивание. Графики позиции z против углы наклона (A) θ и (B) φ для успешного выравнивания, где ● указывает фактические значения измеренных и + указывает лучший подходят с помощью метода наименьших квадратов. (C) граф φ против θ установлены углы с четырьмя точками, где была достигнута максимальная z позиции. Точка пересечения отмечены является окончательной оптимальный наклон по обеим осям. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5. Графики, иллюстрирующие неудачной выравнивание. Графики позиции z против углы наклона (A) θ и (B) φ для неудачного выравнивания, где ● указывает фактические значения измеренных и + указывает лучший подходят с помощью метода наименьших квадратов. (C) граф φ против θ установлены углы с четырьмя точками, где была достигнута максимальная z позиции. Нет четких Оптима или точка пересечения наблюдаются и поэтому оптимальное выравнивание углов не разрешаются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6. Иллюстративный оптической микроскопии и атомно-силовой микроскопии изображений золото субстратов, которые были узорной с МГА в соответствие закона о Госзакупках массивы и затем травлению. (A) и (B) последовательно увеличенное оптической микроскопии образы травлению шаблонов; (C) это изображение топографии AFM одной сетки шаблонов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 7. Иллюстративный оптической микроскопии изображений золото субстратов, которые были узорной с МГА в соответствие закона о Госзакупках массивы и затем травлению. (A) и (B) являются последовательно увеличенное оптической микроскопии изображений травлению шаблонов и (C) ниже увеличение изображение, которое показывает большой площади однородной структуры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 8. Иллюстративный оптической микроскопии образ золотых субстрата, неравномерно с МГА узором и затем травленная. Предполагаемой структуры (см. вставку) повторяющиеся сеток 20 точечных линий, расположенных в 20 линиями, с каждые две линии производства путем увеличения z-оси расширение 1 мкм (от 5 до-5 мкм). Можно увидеть, что в некоторых областях не шаблоны создаются из-за отсутствующих зонды в этих местах. В районах, где производятся только две линии точек, этот результат означает, что зонд присутствует, но это не такой же высоты как полностью функционирующей зонды, поэтому только показывает когда массив расширяется до полной z-оси расстояние. На этом изображении контраст был намеренно изменены, чтобы включить наблюдение за частично печатной области. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 9. Эпифлуоресцентного микроскопии изображений использования, культивируемых на массивах фибронектин шаблонного закона о госзакупках. (A) и (B) являются высокое увеличение изображения показаны отдельные клетки. (C) показывает пример шаблона фибронектин массива без сторонник клеток и (D) представляет собой широкое поле изображение клетки культивировали в механизме сетки (схема набивным рисунком также показано в инкрустации). Клетки запятнаны Показать фибронектина (красный), F-актина (зеленый) и мобильных ядер (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Этот протокол служит для предоставления пользователям с удобным методологии быстро осуществлять nanolithographic, кучность с высокая однородность и размер управляемой функции над большой (см²) областях. Субстраты, принимая эти большие площади nanopatterns может быть далее разработан для различных приложений. Один из основных применение этой технологии в поколения nanofabricated поверхностей для исследования взаимодействия клетк поверхности. Этот отчет показывает некоторые наглядные примеры клеточной культуры на эти материалы, демонстрируя контроля МСК морфологии, nanofabricated субстратов.

Ключевым фактором настоящего Протокола является автоматизация процедуры выравнивания (шаг 4) который позволяет единообразного и высок объём производства функций на поверхностях, вплоть до наноразмерных резолюции, которая позволяет быстрый оборот культуры клеток экспериментов. Литография пером полимера, осуществляется с помощью этого алгоритма выравнивания способен генерировать наноразмерных компонентов в течение примерно 30 мин. Воспроизводимость и точность автоматического выравнивания и таким образом единообразия узорной функций, — однако критически зависит качество зонд массивов, которые производятся (шаг 1 и 2). Любые недостатки в их подготовке, которые приводят к тупым, сломаны или отсутствуют датчики; таких захваченных воздушных пузырьков (шаг 1.5) или неправильное разделение зондов от хозяина (шаг 1.8) может привести к неточной выравнивание и низкого качества литографии.

Это сообщили, что метод разделяет ограничение общего другие методы выравнивания, которые полагаются на силовой обратной связи. Точное определение когда зонды находятся в контакте с поверхностью ограничивается необходимостью учитывать фон вибрации, вызванные окружающей среды и движение на стадии образца. В общем датчики имеют чувствительность силы в µN режиме (2 µN в данном случае), но выравнивание алгоритм предназначен только зарегистрировать силой по крайней мере 490 µN как окончательный контакт между штырями и поверхностью, для того чтобы избежать любых resul «ложных срабатываний» Тин от фонового шума. ¹³ таким образом, этот метод имеет тенденцию производить большие возможности (1-2 мкм) поскольку датчики должны продлен большое расстояние на z-оси (с последующим высшие силы) для того чтобы зарегистрировать контакта. Для того, чтобы компенсировать, меньше функций могут быть получены путем сокращения z-оси пробег на этапе литография (например, введя параметр «Черный» на шаге 5.2.3.2 как 3 мкм вместо 5 мкм).

Тем не менее, даже при этом ограничение, Автоматизация алгоритмов способна решить важнейший аспект в применении методов параллельного сканирования зонд литографии, как выравнивание было ранее наиболее требовательных и неточные шаг по времени в Реализация этих методов. Эта автоматизация теперь переносит ограничения скорости шаг процесса изготовления из выравнивание литографических писать сам. Хотя этот протокол демонстрирует применение этой процедуры выравнивания для PPL, рамки может применяться к ряду SPL методы, такие как липид DPN²⁶ и при содействии матрицы литографии²⁷ , а также потенциального будущего каталитического зонд систем. ²⁸

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
FlexAFM, установленный на моторизованном 5-осевом (XYZΘ Φ) трансляционный и угломерный столик	NanoSurf	P40008
Программное обеспечение для управления АСМ	NanoSurf	C3000
Гравировальная ручка	Sigma-Aldrich	Z225568
Очиститель плазмы	Harrick	PDC-32G-2
PlasmaFlo	Плазма	Harrick PDC-FMG-2
Экономичный сухой кислородный насос для обслуживания	плазмы Harrick	PDC-OPE-2
Трубчатый ротатор	Stuart	SB3
Вакуумный эксикатор	Thermo Fisher Scientific	5311-0250
Milli-Q Система очистки воды	Merck Millipore	ZRXQ015WW
Модульный генератор влажности	proUmid	MHG32
Proline Plus Pipette 100-1000 &; L	Sartorius	728070
Силиконовые мастера	NIL Технология	изготовленных
Вертикальный моментальный флуоресцентный микроскоп	Olympus	BX51
Объективы микроскопа	Olympus	10x и 60x UPlan FLN ∞/-/FN 26.5
Вертикальный светлопольный микроскоп	Leica	DM 2500M
Ультразвуковой аппарат	ООО «Ультравейв»	U95
Электронная таблица для записи и интеграции результатов автоматического выравнивания Microsoft		Excel
Reagent
2-пропанол	Sigma-Aldrich	34863	ЛЕГКОВОСПЛАМЕНЯЮЩИЙСЯ
микроскоп Sildes, Clear, Ground	Thermo Fisher Scientific	451000
(7– 8% винилметилсилоксан)-сополимер диметилсилоксана, триметилсилокси-концевой	Гелест	VDT-731
1,3,5,7-тетраметил-1,3,5,7-тетравинилциклотетрасилоксан	Гелест	SIT7900.0
Платина(0)-1,3-дивинил-1,1,3,3-тетраметилдисилоксан комплекс	раствор Сигма-Олдрич	479527	ВРЕДНЫЙ, ТОКСИЧНЫЙ(
25– 35% метилгидросилоксан)-сополимер диметилсилоксана, триметилсилоксан-концевой	Gelest	HMS-301
Весовая лодка 100 мл	Научные лабораторные принадлежности	BALI828
Пастеровская пипетка	Appleton Woods	KS230
Чашка Петри	SARSTEDT	82.1473
Бритвенное лезвие	Thermo Fisher Scientific	ST10-031T
Клейкая углеродная лента	Agar scientific	AGG3939
16-меркаптогексадекановая кислота	Sigma-Aldrich	448303-1G	ВРЕДНЫЙ, ТОКСИЧНЫЙ
ЭТАНОЛ	Sigma-Aldrich	34852	ЛЕГКОВОСПЛАМЕНЯЮЩЕЕСЯ
Предметное стекло микроскопа с золотым покрытием	Sigma-Aldrich	643203	После вскрытия золото будет оставаться реакционноспособным к тиолам в течение как минимум 1 месяца
Тиомочевина	Sigma-Aldrich	T8656	ВРЕДНЫЙ, ТОКСИЧНЫЙ
Нонагидрат нитрата железа(III)	Sigma-Aldrich	529303	ВРЕДНЫЙ, ТОКСИЧНЫЙ
Соляная кислота	Sigma-Aldrich	84415	ВРЕДНЫЙ, ТОКСИЧНЫЙ(
11-Меркаптоундецил)гекса(этиленгликоль)	Sigma-Aldrich	675105	ВРЕДНЫЙ, ТОКСИЧНЫЙ
Фибронектин из плазмы человека	Sigma-Aldrich	F0895
Гексагидрат нитрата кобальта(II)	Sigma-Aldrich	203106	ВРЕДНЫЙ, ТОКСИЧНЫЙ
Dulbecco' s Фосфатно-солевой буфер	Sigma-Aldrich	D8537
MSCGM Среда для роста мезенхимальных стволовых клеток Lonza	UK	PT-3001
Мезенхимальные стволовые клетки человека	Lonza UK	PT-2501
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4174
Heraeus Multifuge X1 Центрифуга	Thermo Fisher Scientific	75004210
Центрифужные пробирки CELLSTAR	Greiner Bio-One	188261
параформальдегидом	Fisher Scientific	P/0840/53	ВРЕДНЫЙ, ТОКСИЧНЫЙ
Alexa Fluor 488 Фаллоидин	Thermo Fisher Scientific	A12379
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	"Моющее средство" в рукописи
VECTASHIELD Antifade Монтажная среда с DAPI	Vector Лаборатории	H-1200
Rabbit антифибронектиновое антитело	Abcam	ab2413
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Вторичное антитело, Alexa Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	R37117
Бычья сыворотка Альбумин	Sigma-Aldrich	A3912
12-луночная пластина	Thermo Fisher Scientific	10253041
T75 ткань	колба для культуры Thermo Fisher Scientific	10790113
консоль	BudgetSensor	ContAl-G