Análisis clonal de precursores de células madre hematopoyéticas embrionarias usando índice célula clasificación combinada con células endoteliales nicho cultura Co

Resumen

Aquí presentamos la metodología para el análisis clonal de precursores de células madre hematopoyéticas durante el desarrollo embrionario de ratón. Combinación de índice de clasificación de las células de la región aorta-gónada-mesonefros embrionaria con cocultivo de células endoteliales y trasplante para caracterizar las propiedades fenotípicas y el potencial de engraftment de precursores hematopoyéticos individuales.

Resumen

La capacidad de estudiar la génesis de células madre hematopoyéticas (HSC) durante el desarrollo embrionario ha sido limitada por la rareza de los precursores HSC en el embrión y la falta de ensayos que identifican funcionalmente el potencial a largo plazo del engraftment del multilineage de los supuestos precursores HSC. Aquí, describimos la metodología que permite el aislamiento y caracterización de precursores HSC funcionalmente validados a nivel unicelular. En primer lugar, utilizamos índice de clasificación para catalogar el parámetro fenotípico precisa de cada célula individualmente seleccionada, utilizando una combinación de marcadores fenotípicos para enriquecer de precursores HSC con marcadores adicionales para análisis experimental. En segundo lugar, cada célula ordenadas de índice es co cultivada con estroma nicho vascular de la región de aorta-gónada-mesonefros (AGM), que apoya la maduración de los precursores de HSC no engrafting funcional HSC con el engraftment del multilineage, a largo plazo potencial en ensayos de trasplante. Esta metodología permite la correlación de propiedades fenotípicas de precursores hemogenic clonal con su potencial de funcional engraftment u otras propiedades como perfil transcripcional, proporcionar un medio para el análisis detallado del precursor HSC desarrollo a nivel unicelular.

Introducción

Estudios clonales han revelado heterogeneidad en las propiedades a largo plazo del engraftment de adultos HSCs, proporcionar la nueva penetración en subtipos de HSC y cambios en el comportamiento HSC durante envejecimiento¹. Sin embargo, estudios similares de HSCs embrionarias y sus precursores han sido más difícil. Durante el desarrollo embrionario temprano, HSCs surgen de una población de precursores conocido como endotelio hemogenic en un proceso transitorio que se refiere como endoteliales hematopoyético transición². El primer HSC, definido por su capacidad para proporcionar engraftment del multilineage robusto, a la....

Protocolo

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) del Fred Hutchinson Cancer Research Center.

1. preparación de monocapas de AGM-EC para el cocultivo

1. 24 h antes de la disección de la AGM y tipo, hacer medios de cultivo EC AGM y filtro de esterilización.
2. Agregar 0.1% de gelatina en agua (100 μL/pocillo) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos e incubar a temperatura ambiente durante 15 min aspirar la gelatina y dejar la placa en una campana de cultivo de tejidos con la tapa quitada hasta que los pozos están secos.
3. Disociar las monocapas d....

Resultados

Figura 1A se muestra un esquema del diseño experimental. Una vez tejidos P-Sp/AGM son disecados, agrupados y disociados en la colagenasa, se mancharon con anticuerpos contra VE-cadherina y EPCR para clasificar el índice. Pre-HSC están enriquecidos en células ordenadas en VE-cadherina⁺EPCR^alta (figura 1B). Otros anticuerpos conjugados con fluorocromo puede incluidas analizar retrospectivamente los parámetros .......

Discusión

El estudio de la génesis de la HSC durante el desarrollo embrionario requiere medios para detectar posible precursores de hemogenic aún falta la competencia para proporcionar a largo plazo del multilineage reconstitución hematopoyética en recipientes adultos trasplantados de HSC. En este protocolo, presentamos un ensayo clonal de precursores hemogenic embrionario por co-cultivo stromal vascular nicho ECs de la Junta General, que apoya la maduración de los precursores de HSC, con posterior análisis funcional en los ensayo.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medios de cultivo AGM-EC
Materiales para el cultivo de células endoteliales
TrypLE Express	Gibco	12605-028	Uso para disociar monocapas de AGM-EC Gelatina
0,1% en agua	StemCell Technologies	7903	Úselo para adherir monocapas de AGM-EC al plástico
Placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos	Corning	3599	Úselo para cocultivar monocapas AGM-EC y clones clasificados por índice
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS)	Gibco	14190-144	Uso para disección y tinción FACS
Frascos de filtro de 500 ml	Fisher Scientific 9741202		Uso para filtrar estériles Medios endoteliales
AGM-EC medios de cultivo (500 mls)
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco	12440-053	400 mls
Hyclone Fetal Bovine	Serum Fisher Scientific	SH30088.03	100 mls
Penicilina Estreptomicina	Gibco	15140-122	5 mls
Heparina	Sigma	H3149	50 mg disueltos en 10 mls
medio L-glutamina (200 mM)	StemCell Technologies	7100	5 mls
mitógeno endotelial (ECGS)	Alfa Aesar	J64516 (BT-203)	Agregue 10 ml de medio para disolver y agregue
Materiales para clasificación de índice AGM
0.25%)	StemCell Technologies	7902	Uso para la disociación de tejidos embrionarios
jeringa de 3 ml	BD Biosciences	309657	Úselo para filtrar soluciones de anticuerpos estériles para FACS
0.22 y micro; M filtro accionado por jeringa	Millipore SLGP033RS		Úselo para filtrar estériles soluciones de anticuerpos para FACS
Tubo de poliestireno de 5 ml con tapón de filtro de células	Corning	352235	Úselo para eliminar los grumos de células antes de FACS
DAPI (preparado como stock de 1 mg/ml en H2O)	Millipore	268298	Úselo para excluir células muertas de la clasificación
anti-ratón CD16/CD32 (bloque FcR)	BD Biosciences	553141	Se utiliza para bloquear la tinción inespecífica de los receptores Fc
Anticuerpos para el índice AGM Tipo
Anti-ratón CD144 PE-Cyanine7	eBioscience	25-1441-82	Tinción de
rata IgG1 kappa Control de isotipo, PE-Cyanine7	eBioscience	25-4301-81 Control de	isotipo para CD144 PE-Cyanine7
Anti-ratón CD201 (EPCR) PerCP-eFluor710	eBioscience	46-2012-80	Tinción de
rata IgG2b kappa Control de isotipo, PerCP-eFlour710	eBioscience	46-4031-80	Control de isotipo para CD201 PerCP-eFluor710
Anti-ratón CD41 PE	BD Biosciences	558040	Rata tintorera
IgG1 kappa Control de isotipo, PE	BD Biosciences	553925	Control de isotipo para CD41 PE
Anti-ratón CD45 FITC	eBioscience	11-0451-85	Tinción
rata IgG2b kappa Control de isotipo, FITC	eBioscience	11-4031-81	Control de isotipo para CD45 FITC
AGM-medios libres de suero (10 mls)
X-Vivo 20	Lonza	04-448Q	10 mls
factor de células madre murinas recombinantes (SCF)	Peprotech	250-03	10 ml (100 mg/ml de stock) Concentración final 100 ng/ml
de ligando FLT3 humano recombinante (FLT3L)	Peprotech	300-19	10 ml (100 mg/ml de stock) Concentración final 100 ng/ml
de trombopoyetina humana recombinante (TPO)	Peprotech	300-18	2 ml (100 mg/ml de stock) Concentración final 20 ng/ml
de interleucina-3 (IL3) murina recombinante)	Peprotech	213-13	2 ml (100 mg/ml de stock) Concentración final 20 ng/ml
Materiales para la tinción de células co-cultivadas
placa de pocillos de 96, fondo en V	Corning	3894	Uso para el análisis de FACS
Anticuerpos para el análisis de clones clasificados por índice co-cultivados con células endoteliales
Anti-ratón CD45 PerCP-Cyanine5.5	eBioscience	45-0451-82	Tinción de
rata IgG2b kappa Control de isotipo, PE-Cianina5.5	eBioscience	35-4031-80	Control de isotipo para CD45 PerCP-Cianina5.5
Anti-ratón CD201 (EPCR) PE	eBioscience	12-2012-82	Rata tintorera
IgG2b kappa Control de isotipo, PE	eBioscience	12-4031-81 Control de	isotipo para CD201 PE
Anti-ratón Ly-6A/E (Sca-1) APC	eBioscience	17-5981-83	Control
IgG2a kappa, APC	eBioscience	17-4321-81	Control de isotipo para Ly-6A/E APC
Anti-ratón F4/80 FITC	eBioscience	11-4801-81	Rata de tinción
IgG2a kappa Control de isotipo, FITC	eBioscience	11-4321-41 Control de	isotipo para F4/80 FITC
Anti-ratón Ly-6G/C (Gr1) FITC	BD Biosciences	553127	Tinción de
rata IgG2b kappa Control de isotipo, FITC	BD Biosciences	556923	Control de isotipos para Ly-6G/C y CD3 FITC
Materiales para inyección de venas de cola para trasplante
1/2 ml con agujas de 29G 1/2"	BD Biosciences	309306	Uso para inyección de venas de cola para trasplante
para el análisis de sangre periférica después de la tinción translante
anti-ratón Ly-6G/C (Gr1) PerCP	Biolegend	108426	Rata de tinción
IgG2b kappa, PerCP	Biolegend	400629	Control de isotipo para Ly-6G/C PerCP
Anti-ratón F4/80 PE	eBioscience	12-4801-82	Tinción
Rata IgG2a kappa Control de isotipo, PE	eBioscience	12-4321-80	Control de isotipo para F4/80 PE
Anti-ratón CD3 FITC	BD Biosciences		555274 Tinción
Anti-ratón CD19 APC	BD Biosciences	550992	Tinción Rata
IgG2a kappa Control de isotipo, APC	BD Biosciences	553932	Control de isotipo para CD19 APC
Anti-ratón CD45.1 (A20) PE-Cianina7	eBioscience	25-0453-82	Control de
IgG2a kappa, PE-Cyanine7	eBioscience	25-4321-81 Control de	isotipo para CD45.1 PE-Cyanine7
Anti-ratón CD45.2 (104) APC-eFluor780	eBioscience	47-0454-82	Control de
isotipo de rata de tinción IgG2a kappa, APC-eFluor780	eBioscience	47-4321-80 Control de	isotipo para CD45.2 APC-eFluor780
Equipment
BD FACSAria II con software DIVA	BD Biosciences
BD FACSCanto II con lector de placas	BD Biosciences
Hemocitómetro	Fisher Scientific	S17040	Para el recuento
de células Pipeta multicanal	Fisher Scientific	14-559-417	para células dosificadoras
software de análisis FACS	FlowJo/BD Biosciences		https://www.flowjo.com/solutions/flowjo

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