ヘリコバクター ・ ピロリ感染と胃の病理のマウス ・ モデル
Summary
マウスは、感染症や消化管微生物によって引き起こされる病気を研究する非常に貴重な生体内でモデルを表します。ここで、細菌の植民地化およびピロリ菌のマウス ・ モデルにおける病理組織学的変化を研究するために使用するメソッドを説明-関連の病気。
Abstract
ピロリ菌は、世界の人口の半分に存在し人間の死亡率と罹患率の重要な原因は、胃の病原体です。胃ヘリコバクター ・ ピロリ感染症のいくつかのマウス モデルというピロリ菌の人間のホストの胃を植民地化し、病を引き起こす分子・細胞メカニズムの研究開発されています。ここに、プロトコルについて述べる: 1) 胃内強制経口投与; を介してマウスの生体内感染の細菌懸濁液を準備2) ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR)、生菌数計測; マウス胃組織で細菌の植民地化のレベルを決定します。3) 組織学による病理学的変化を評価します。Helicobact小胞体に感染するのにマウス、特定病原体フリー (SPF) 動物は最初に懸濁液 (≥105コロニー形成単位、CFUs を含む) のいずれかのピロリ菌の系統のマウス-植民地化と再接種または動物から他胃のヘリコバクター属などピロリ felis 。適切な時点後感染症で胃は切除、幽門部と体の領域を構成する各 2 等しい組織片に大の解剖。他は組織学的処理に服従する中、これらのフラグメントの 1 つ、生菌数計測または DNA の抽出のいずれかの使用されます。細菌の植民地化および胃の病理組織学的変化は、胃組織切片を腺リンパ星空、ギムザまたはヘマトキシリンとエオシン (H & E) 汚れに応じて染色で日常的に評価が。免疫組織化学またはマウス胃組織切片を蛍光抗体法によって追加の免疫学的解析を実施もことがあります。下記プロトコルを人間関連のh. ピロリ菌に似た胃の病態のマウスの評価を有効にする設計疾患、炎症、腺萎縮とリンパ濾胞形成を含みます。接種材料の準備および胃内強制経口投与プロトコルもサルモネラ菌やシトロバクター属齧歯類などのマウスを植民地化他の腸溶性ひと病原体の病因を研究に適応させること。
Introduction
ピロリ菌、螺旋状で、グラム陰性菌、人間胃病原体すべての人口で現在 801順と推定される開発途上国の感染率で、世界中。ほとんどピロリの感染した人はいくつかのより重篤な疾患、胃癌2消化性潰瘍に至る開発、無症候性であります。H. ピロリ菌の上皮細胞 (GECs) の悪性変化またはリンパ節外胃、胃腺癌の結果または粘膜関連リンパ組織の形成によって関連付けられている癌の特徴広くティッシュ (モルト) リンパ腫、それぞれ。H. ピロリ菌は様々 な病原性因子とその付着、成長、このニッチ市場で代謝を促進する機構が存在するため胃の過酷な生態学的ニッチ市場で生き残るために適応高。特に、ピロリ菌の病原性菌株所有 40 kb cag病原性アイランド (cagパイ) タイプ 4 分泌システム (T4SS)3,4 の生産のために必要な約 30 遺伝子をエンコードします。.cagPAI 陽性ピロリ菌は胃癌の5の重要な前駆体として関与しているホストの慢性的な炎症のより高いレベルの誘導に関連付けられています。
ホスト、ピロリ感染と病気の結果6細菌と環境要因の相対的な貢献を調査する研究者を許可することで、生体内で動物モデル、特にマウスを非常に有益されています。H. ピロリ菌を延長する以前の調査は示した感染症慢性胃炎および腺の開発における C57BL/6 遺伝的背景結果上でマウスの萎縮、ピロリ感染7の両方の特徴。さらに、似たような病理と病進行人間 MALT リンパ腫8,9に見られるようにマウスで麦芽の形成を誘導する関連猫/犬細菌種H. felis感染が示されています。H. ピロリ菌を使用頻度の高いマウス植民地研究の分離は「シドニーひずみ 1」(SS1) ひずみ10、 cagパイ+ですが、非機能的な T4SS を持つ (T4SS−)11。他の広く使用されている系統は、 h. ピロリ菌B128 7.13 (cagパイ+/T4SS+)12 X47 2AL (cagパイ–/T4SS−)13。H. felis感染症、ひずみ CS1 (「猫スパイラル 1 を」、 cagパイ–/T4SS−) 一般的に使用される14。
本明細書で提供体内感染ヘリコバクター ・ ピロリ接種、マウスの胃内強制経口投与の手順だけでなく、病理組織学的変化の研究のためのティッシュの処理の方法の準備を記述するプロトコル胃。特に、この記事細菌の植民地化を視覚化し、感染マウスの胃粘膜における麦芽の形成を含む、病理組織学的変化を評価するために使用する組織学的方法に焦点を当てます。ここで説明する方法のいくつかはs.など他の腸病原体の研究に適応させることネズミチフス菌またはC. 囓。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、ヘリコバクター ・ ピロリ感染症のため生体内でマウス モデルの使用について説明します。プロシージャの重要なステップは、: 1) 実行可能なおよび運動性細菌を含むヘリコバクター ・ ピロリ接種の準備2) 胃内強制経口投与; 経由のマウスへの細菌の適切な数の配信3) コロニー カウントおよび/または pcr 法による細菌感染症の検出・ 4) の病理組織?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、さん A. ・ デ ・ パオリとさんジョージー Wray マッキャンにテクニカル サポートに感謝したいと思います。著者は、モナッシュ組織プラットフォーム、解剖学と発生生物学、モナッシュ大学の技術支援施設の利用を認めます。研究室は、RLF (APP1079930、APP1107930) に国立保健医療研究審議会 (NHMRC) からの資金によってサポートされます。RLF は NHMRC (APP1079904) から上級研究員によってサポートされます。モナッシュ大学院奨学金、KD と MC を両方ともサポートします。KD もサポートされてセンター自然免疫とハドソン研究所医学研究の感染性疾患の MC に医学部、看護、保健、モナシュ大学からの国際大学院奨学金があるとき。医学研究のハドソン研究所での研究は、ビクトリア朝の政府の運用インフラストラクチャ サポート プログラムによってサポートされます。
Materials
| Bacteriological reagents | |||
| Oxoid Blood Agar Base No.2 | Thermo Fischer Scientific | CM0271B | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| Premium Defibrinated Horse blood | Australian Ethical Biologicals | PDHB100 | |
| Bacto Brain Heart Infusion Broth | BD Bioscience | 237500 | Dissolve in deinonized water prior to sterilization |
| CampyGen gas packs | Thermo Fischer Scientific | CN0035A/CN0025A | |
| Histological reagents | |||
| Formalin, neutral buffered, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Absolute alcohol, 100% Denatured | ChemSupply | AL048-20L-P | |
| Isopropanol (2-propanol) | Merck | 100995 | |
| Xylene (sulphur free) | ChemSupply | XT003-20L | |
| Mayer's Haematoxylin | Amber Scientific | MH-1L | Filter before use |
| Eosin, Aqueous Stain | Amber Scientific | EOCA-1L | Filter before use |
| Wright-Giemsa Stain, modified | Sigma Aldrich | WG80-2.5L | Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water) |
| Histolene | Grale Scientific | 11031/5 | |
| DPX mounting medium | VWR | 1.00579.0500 | |
| Molecular biology reagents | |||
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fischer Scientific | Q32850 | |
| Oligonucleotides | Sigma Aldrich | The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61°C | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8291 | Kit includes 10X PCR buffer and Magnesium Chloride |
| dNTPs | Bioline | BIO-39028 | Dilute to 10mM in sterile nuclease free water before use |
| Molecular Grade Agarose | Bioline | BIO-41025 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Univar (Ajax Fine Chemicals) | A475-500G | |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Chem-Supply | MA048-500G | |
| Antibiotics | |||
| Vancomycin | Sigma Aldrich | V2002-1G | Dissolve in deionized water |
| Polymyxin B | Sigma Aldrich | P4932-5MU | Dissolve in deionized water |
| Trimethoprim (≥98% HPLC) | Sigma Aldrich | T7883 | Dissolve in 100% (absolute) Ethanol |
| Amphotericin | Amresco (Astral Scientific) | E437-100MG | Dissolve in deionized water |
| Bacitracin from Bacillus licheniformis | Sigma Aldrich | B0125 | Dissolve in deionized water |
| Naladixic acid | Sigma Aldrich | N8878 | Dissolve in deionized water |
| Other reagents | |||
| Methoxyflurane (Pentrhox) | Medical Developments International | Not applicable | |
| Paraffin Wax | Paraplast Plus, Leica Biosystems | 39601006 | |
| Equipment and plasticware | |||
| Oxoid Anaerobic Jars | Thermo Fischer Scientific | HP0011/HP0031 | |
| COPAN Pasteur Pipettes | Interpath Services | 200CS01 | |
| Eppendorf 5810R centrifuge | Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4°C | ||
| 23g precision glide needle | BD Bioscience | 301805 | |
| Parafilm M | Bemis, VWR | PM996 | |
| Portex fine bore polythene tubing | Smiths Medical | 800/100/200 | |
| Plastic feeding catheters | Instech Laboratories | FTP20-30 | |
| 1 ml tuberculin luer slip disposable syringes | BD Bioscience | 302100 | |
| Eppendorf micropestle for 1.2 – 2 mL tubes | Sigma Aldrich | Z317314 | Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization |
| GentleMACs Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue |
| M Tubes (orange cap) | Miltenyi Biotec | 30-093-236 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fischer Scientific | Q33216 | |
| Sterile plastic loop | LabServ | LBSLP7202 | |
| Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System | Leica Biosystems | Not applicable | |
| Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6 | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4124 | |
| Tissue-Tek III Uni-Casette System | Sakura, Alphen aan den Rijn | 4170 | |
| Microtome, Leica RM2235 | Leica Biosystems | ||
| Charged SuperFrost Plus glass slides | Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific | 4951PLUS4 |
References
- Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications. Helicobacter. 16, 1-9 (2011).
- Montecucco, C., Rappuoli, R. Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).
- Akopyants, N. S., et al. Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).
- Censini, S., et al. cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).
- Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy. Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).
- O’Rourke, J. L., Lee, A. Animal models of Helicobacter pylori infection and disease. Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).
- Sakagami, T., et al. Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis. Gut. 39 (5), 639-648 (1996).
- Correa, P. Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis. The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).
- Enno, A., et al. MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma. The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).
- Lee, A., et al. A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain. Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).
- Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island. Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).
- Israel, D. A., et al. Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses. Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).
- Fox, J. G., et al. Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat. Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).
- Lee, A., Hazell, S. L., O’Rourke, J., Kouprach, S. Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach. Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).
- Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens. Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).
- Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection. Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).
- Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. Laboratory maintenance of Helicobacter species. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
- Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).
- Nedrud, J. G., et al. Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa. Frontiers in Immunology. 3, 181 (2012).
- Cai, X., et al. Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice. Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).
- Ferrero, R. L., Labigne, A. Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes. Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).
- Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media. Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).
- Uotani, T., Graham, D. Y. Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test. Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9 (2015).
- Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses. Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).
- Chaouche-Drider, N., et al. A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells. PLoS One. 4 (4), e5396 (2009).
- Fox, J. G. Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease. Gut. 56 (7), 898-900 (2007).
- McGee, D. J., et al. Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).
- Viala, J., et al. Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island. Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).
- Kong, L., et al. A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).
- Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis. Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).
- Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions. The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).
