通过双光子激光对细胞膜造成损伤是评估细胞膜修复能力的常用方法，可应用于多种细胞类型。本文介绍了一种实验方案 体外 活体成像双光子激光消融后肌萎缩蛋白病患者细胞的膜修复过程
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摘要
摘要
多种病理生理损伤可导致细胞膜受损，当这些损伤与细胞膜修复或完整性的先天缺陷相结合时，可能引发疾病。因此，阐明细胞膜修复相关的分子机制，对于开发针对细胞膜动力学功能障碍相关疾病的新型治疗策略具有重要意义。许多 体外 和 在体内 旨在研究多种疾病背景下细胞膜修复机制的研究常采用双光子激光消融技术，作为评估实验处理后功能结果的标准方法。在该检测中，利用双光子激光对细胞膜造成损伤，导致细胞膜破裂并使荧光染料进入细胞内。随后可通过监测细胞内荧光强度的变化，定量分析细胞自我修复的能力。目前存在多种评估细胞膜损伤反应的替代方法，且双光子激光损伤技术本身也存在较大差异，因此建立一种统一、标准化的细胞损伤模型将有助于减少不同方法之间的变异。本文概述了一种用于评估细胞膜修复能力的简易双光子激光损伤实验方案 体外 在转染或未转染全长dysferlin质粒的健康人和dysferlinopathy患者成纤维细胞中。
引言
真核细胞的细胞膜由双层镶嵌蛋白质的磷脂构成，它界定了细胞的胞内/胞外环境，对维持细胞稳态和细胞存活至关重要。由机械或化学损伤引起的细胞膜损伤在多种哺乳动物细胞类型中十分常见，包括骨骼肌和心肌细胞、胃细胞以及肺细胞1,2,3,4。除了日常生理功能所导致的损伤外，细胞膜还可能受到环境因素、细菌毒素以及缺血再灌注的损害5。若细胞膜破裂后无法重新封闭，将导致细胞外Ca2+及其他潜在有毒的胞外成分不受调控地涌入细胞内，进而激活下游信号级联反应，最终迅速引发细胞死亡1,4,5,6。
迄今为止，已有多种关于细胞膜修复的模型被提出。不同的修复机制可能根据膜破裂的大小和性质被激活。例如，有研究认为细胞膜可能通过侧向流动或蛋白质堵塞来修复微小损伤（<1 nm）。侧向融合模型提出，膜破裂可通过快速募集含dysfer....
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方案
本研究中使用的人成纤维细胞已获得阿尔伯塔大学医学与牙科学院人类伦理委员会的批准。
1. 使用全长 DYSF 质粒转染细胞
- 在含有 40 mL 生长培养基（36 mL 达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）、4 mL 胎牛血清（FBS）和 20 µL 青霉素/链霉素（P/S））的 T225 培养瓶中培养成纤维细胞，置于 37°C 的 CO2 培养箱中。
注意：细胞应培养至约 70–80% 汇合度，不应让其完全汇合。 - 为接种细胞做准备，用 40 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞两次，然后加入 5 mL 0.05% 胰蛋白酶以使细胞脱落。将细胞放回 37°C CO2 培养箱，孵育 5 分钟。
- 当细胞完全脱落时，加入 40 mL 生长培养基以终止胰蛋白酶反应。
- 使用血细胞计数板或其他细胞计数装置对细胞进行计数。
- 将浓度为 1×105 个细胞/mL 的 2 mL 细胞悬液接种至 35 mm 胶原包被的玻璃底培养皿中。在 37°C 的 CO2 培养箱中过夜孵育。
注意：次日细胞汇合度应约为 50–60%。 - 移除生长培养基，并替换为 2 mL 无血清培养基（不含 FBS 的生长培养基）。
- 使用脂质体....
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结果
对健康人成纤维细胞、未经处理的肌营养不良蛋白病患者成纤维细胞以及转染了含有全长dysferlin序列质粒的患者成纤维细胞进行双光子激光损伤，以实时评估细胞膜的修复能力。激光损伤后，健康人成纤维细胞表现出较低水平的FM 4-64荧光激活，而未经处理的患者成纤维细胞在损伤后显示出较高的相对荧光强度（图5&6）。转染了全长dysferlin质粒的患者细胞其相对FM 4-64荧光强度较未经处理的患者对照组降低，且与健康对照组观察到的荧光值相当（图5&6）。
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讨论
双光子激光损伤细胞膜是一种用于评估膜修复动态过程的精确且多功能的技术 体外本文介绍了一种利用双光子激光损伤检测法测定肌萎缩蛋白病患者细胞膜修复能力的实验方案。我们的结果显示，肌萎缩蛋白病患者的细胞在细胞膜修复方面存在缺陷，该结果与其他研究者的发现一致，进一步凸显了肌肉细胞与非肌肉细胞在细胞膜修复动力学方面的显著相似性。3,11,15,22我们还观察到，转染了含有全长dysferlin序列质粒的患者细胞，其膜修复缺陷表型得到了挽救，表明全长dysferlin质粒不仅可在肌肉细胞中，也可在非肌肉细胞类型中挽救表型27.
综上所述，我们的结果进一步验证了双光子细胞膜损伤实验在评估细胞膜修复能力方面的可行性和可靠性，使其成为该领域的金标准方法 体外然而.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由阿尔伯塔大学医学与牙科学院、Garrett Cumming 研究主席基金之友、HM Toupin 神经科学研究中心基金、加拿大肌肉萎缩症协会、加拿大创新基金会（CFI）、阿尔伯塔省先进教育与技术部（AET）、加拿大卫生研究院（CIHR）、Jesse's Journey — 基因与细胞治疗基金会、妇女与儿童健康研究所（WCHRI）以及阿尔伯塔创新健康解决方案（AIHS）提供支持。
我们感谢 Steven Laval 博士为我们提供了全长 dysferlin 质粒。我们还要感谢 Katsuya Miyake 博士提供的技术指导。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Thermo Fisher | 11320033 | |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | F1051 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | Thermo Fisher | 15140122 | |
| 胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红 | Thermo Fisher | 25300062 | |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 35 mm 胶原包被的玻璃底培养皿 | MatTek | P53GCOL-1.5-14-C | |
| 无血清培养基 | Thermo Fisher | 31985070 | |
| 转染试剂 | Thermo Fisher | 15338100 | |
| FM 4-64 染料 | Invitrogen | T13320 | |
| Tyrode’s 盐溶液 | Sigma-Aldrich | T2397 | |
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Carl Zeiss | NA | |
| Chameleon 双光子激光器 | Coherent | NA |
参考文献
- Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).
- Demonbreun, A. R., McNally, E. M. Plasma Membrane Repair in Health and Disease. Curr Top Membr. 77
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重印与许可
