Eencellige resolutie fluorescentie leven beeldvorming van Drosophila circadiane klokken in larvale hersenen cultuur
Summary
Het doel van dit protocol is om de ex vivo Drosophila larvale hersenen cultuur, geoptimaliseerd voor het controleren van de circadiane moleculaire ritmes met langdurige fluorescentie time-lapse beeldvorming. De toepassing van deze methode op farmacologische testen wordt ook besproken.
Abstract
Het circuit van de circadiane pacemaker regisseert ritmische gedrags- en fysiologische uitgangen gecoördineerd met milieu signalen, zoals dag/nacht cyclus. De moleculaire klok binnen elke pacemaker neuron genereert circadiane ritmen in genexpressie, ten grondslag liggen, de ritmische neuronale functies noodzakelijk zijn voor de werking van het circuit. Onderzoek naar de eigenschappen van de individuele moleculaire oscillatoren in verschillende subklassen van pacemaker neuronen en hun interactie met de neuronale signalering levert een beter begrip van het circadiane pacemaker-circuit. Hier presenteren we een time-lapse fluorescent microscopie aanpak ontwikkeld voor het controleren van de moleculaire uurwerk in klok neuronen van gekweekte Drosophila larvale hersenen. Deze methode staat de meerdaagse opname van de ritmes van genetisch gecodeerde fluorescerende circadiane verslaggevers bij eencellige resolutie. Deze setup kan worden gecombineerd met farmacologische manipulaties nauw analyseren real-time respons van de moleculaire klok op verschillende verbindingen. Buiten de circadiane ritmes biedt deze multifunctionele methode in combinatie met krachtige Drosophila genetische technieken de mogelijkheid om te bestuderen van de diverse neuronale of moleculaire processen in levende hersenweefsel.
Introduction
Circadiane klokken helpen organismen aan te passen aan de periodieke veranderingen in het milieu die zijn gegenereerd door de 24u draaiing van de aarde. De interlocked transcriptionele-translationeel feedbacklussen vaak ten grondslag liggen de moleculaire machine van circadiane klokken over soorten1. Het circuit van de circadiane pacemaker bestaat uit de klok-bevattende neuronen integreert tijd van de dag informatie overgebracht door middel van de ecologische signalen, zoals de licht/donker (LD) en temperatuur cycli, om te orkestreren de ritmes van een overvloed aan dagelijks fysiologische en gedragsmatige processen2,3. De coördinatie van de moleculaire ritmes met neuronale inputs en outputs is uitermate belangrijk voor de werking van de circadiane circuit maar blijft slechts ten dele begrepen.
In Drosophila, de kern van de moleculaire klok, de klok/cyclus (CLK/CYC) heterodimer activeert de transcriptie van periode (per) en tijdloze (tim). PER TIM vormen een complex en voeren de kern, waar ze transcriptionele activiteit van CLK/CYC en daarmee hun eigen transcriptie remmen. Post-transcriptional en posttranslationele verordeningen veroorzaken vertragingen tussen CLK/CYC-gemedieerde transcriptie en repressie door PER / TIM, zorgen voor de generatie van circa 24 uur moleculaire oscillaties1,3,4 . Ongeveer 150 neuronen die deze moleculaire klokken-formulier bevat vliegt een circuit tot controle circadiane gedrag van volwassene5. Een veel eenvoudiger maar volledig functionele circadiane circuit dat bestaat uit 3 groepen van neuronen van de klok – 5 ventrale laterale neuronen (LNvs; 4 PDF-positieve LNvs en één PDF-negatieve LNv, zie hieronder), 2 dorsale Neuron 1s (DN1s) en 2 dorsale Neuron 2s (DN2s) – is aanwezig in het larvale hersenen6,7.
Het eenvoudige larvale circadiane circuit biedt een uitstekend model voor het bestuderen van de interacties tussen Inter neuronale communicatie en de moleculaire uurwerk. Met behulp van onze nieuw ontwikkelde fluorescerende verslaggever PER-TDT, die de hoeveelheid PER eiwit en haar subcellular locatie bootst, wilde wij karakteriseren de dynamiek van de moleculaire uurwerk in verschillende klok neuron subgroepen in het larvale circadiane circuit 8. Bovendien, te weten de sleutelrol van de neuropeptide pigment-dispersing factor (PDF) geproduceerd door 4 LNvs bij het reguleren van de circadiane ritmen bij de neuronale niveau9,10,11, we wilden onderzoeken van de directe effect van de PDF op de moleculaire klokken. Te dien einde ontwikkelden we een methode voor het controleren van de circadiane genexpressie ritmes in larvale hersenen over meerdere dagen door time-lapse confocale microscopie explant. Het protocol is ook aangepast voor farmacologische testen om te testen van het effect van PDF of andere verbindingen op het niveau van de PER-TDT. Dus, de aanpassing bestaat uit de hersenen explant cultuur toegankelijk maken voor toepassing van de drug, verhoging van de temporele resolutie en imaging voor een kortere duur.
Ex vivo cultuur van Drosophila hersenen van verschillende ontwikkelingsstadia geweest tevoren vastgelegde12,13,14,15,16,17 ,18. Overwegende dat deze protocollen zijn gebruikt voor imaging-verschillende biologische fenomenen, sommige van hen zijn niet compatibel met beeldvorming bij eencellige resolutie of bieden geen ondersteuning voor de cultuur voor meer dan enkele uren. Alternatieve methoden voor het uitvoeren van langdurige live beeldvorming van circadiane neuronen in Drosophila omvatten bioluminescentie beeldvorming van moleculaire ritmes19,20,21 en fluorescentie beeldvorming van calcium-indicator met licht blad microscopie22,23. Hoewel bioluminescentie imaging hogere temporele resolutie bereiken kan en lichte blad microscopie aangepast voor in vivo imaging worden kan, ze zijn beperkt op de ruimtelijke resolutie en vereisen gespecialiseerde Microscoop systemen.
De hier beschreven methode is toegesneden op het visualiseren van fluorescerende signalen in de hele hersenen cultuur bij eencellige resolutie over meerdere dagen. Deze facile en veelzijdige methode kan worden aangepast naar afbeelding gekweekte volwassen vliegen hersenen en farmacologische experimenten veel verschillende problemen in Drosophila neurobiologie te bestuderen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreven we de methode voor de lange termijn fluorescentie time-lapse microscopie van gekweekte larvale hersenen. Het succes van dit soort experimenten hangt van meerdere factoren, zoals de gezondheid van de cultuur, methode voor immobilisatie van de hersenen explant, fluorescentie intensiteit en signaal-/ ruisverhouding van de verslaggever, temporele en ruimtelijke resolutie, en toegankelijkheid van de explant. Deze factoren kunnen uitsluiten. Bijvoorbeeld, verhogen van time-lapse frequentie beïnvloedt de gezond…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Michael Rosbash voor zijn mentorschap en ondersteuning tijdens de eerste fase van de ontwikkeling van deze methode. Dit werk werd gefinancierd door het JST PRESTO programma, de Swiss National Science Foundation (31003A_149893 en 31003A_169548), de European Research Council (ERC-StG-311194), Novartis Foundation for Medical-biomedisch onderzoek (13A39) en de Universiteit van Genève .
Materials
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose "suitable for insect cell culture" whenever available |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| D-(+) Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I0516-5ML | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B4429 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S9512 | |
| Fumaric acid | Sigma-Aldrich | F8509 | |
| α-Ketoglutaric acid | Sigma-Aldrich | K1128 | |
| Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened | BioConcept Ltd. Amimed | 2-01F30-I | |
| HEPES-KOH, pH 7.4 | E&K Scientific Products | EK-654011 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S5011 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Calbiochem (Merck) | 341573-1GM | CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | CAUTION: Health Hazard, use gloves |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | custom made | |
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes | fisherscientific | 08-772A | |
| Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 μm | Millipore | SCGPS05RE | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) film | Dupont | 200A Teflon FEP Film | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLHV033RS | |
| Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized | Millipore | SLGV033RS | |
| Three-well glass dissection dish | Any company | ||
| Fine forceps, size 5, Dumont | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| Temperature control chamber | Life Imaging Services | The CUBE & BOX temperature control system, custom designed | |
| Stage-top humidity controller | Life Imaging Services | custom made | |
| Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| SUM-stack creation and 3D correction drift plugin | ImageJ software | ||
| 10x iterative deconvolution | AutoQuant and Imaris software |
References
- Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella?. Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).
- Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. The clock shop: coupled circadian oscillators. Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).
- Zhang, Y., Emery, P. Chapter 15 – Molecular and neural control of insects circadian rhythms. Insect molecular biology and biochemistry. , 513-551 (2012).
- Hardin, P. E. Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila. Adv Genet. 74, 141-173 (2011).
- Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila. Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).
- Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila. J Biol Rhythms. 19 (1), 10-21 (2004).
- Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45 (2), 293-300 (2005).
- Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock. Sci Rep. 7, 41560 (2017).
- Hyun, S., et al. Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF. Neuron. 48 (2), 267-278 (2005).
- Lear, B. C., et al. A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior. Neuron. 48 (2), 221-227 (2005).
- Mertens, I., et al. PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors. Neuron. 48 (2), 213-219 (2005).
- Ayaz, D., et al. Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila. J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).
- Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains. J Vis Exp. (65), (2012).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol Biol Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Zschatzsch, M., et al. Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling. Elife. 3, e01699 (2014).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. (37), (2010).
- Roberts, L., et al. Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony. Curr Biol. 25 (7), 858-867 (2015).
- Sehadova, H., et al. Temperature entrainment of Drosophila’s circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain. Neuron. 64 (2), 251-266 (2009).
- Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution. J Biol Rhythms. 25 (3), 228-232 (2010).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo. Science. 351 (6276), 976-981 (2016).
- Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs. Neuron. , (2017).
- Kuppers-Munther, B., et al. A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses. Dev Biol. 269 (2), 459-478 (2004).
- Schneider, I. Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro. J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).
- Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O’Dowd, D. K. Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels. J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).
- Hafer, N., Schedl, P. Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (1), e85 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling. Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation. Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).
- Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).
- Lukinavičius, G., et al. SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy. Nature Communications. 6, 8497 (2015).
- Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants. Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).
- Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system. J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, (2015).
- Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain. J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).
