生産およびバキュロ ウイルスの遺伝子治療応用のための浄化
Summary
このプロトコルでバキュロ ウイルスは Sf9 細胞にトランスフェクション バキュロ ウイルス プラスミドのプロデュース、無血清培養で増幅されます。上清はヘパリン親和性クロマトグラフィーによる精製、超遠心法でさらに集中しています。このプロトコルは、生産およびバキュロ ウイルス遺伝子治療応用のための浄化に役立ちます。
Abstract
バキュロ ウイルスは、組換えタンパク質、ワクチンの生産のため伝統的に使用されています。しかし、最近では、バキュロ ウイルスは遺伝子治療応用のための有望なベクトルとして現れています。ここでは、バキュロ ウイルス バキュロ ウイルス プラスミド DNA (バクミド) のトランスフェクション Sf9 細胞の付着性文化で生産されています。バキュロ ウイルスは、希望の音量が得られるまでその後 Sf9 細胞の無血清培養に拡張されます。それは、ヘパリン親和性クロマトグラフィーを用いた培養上清の文化から精製します。ウイルス上清は、バキュロ ウイルスのエンベロープ糖蛋白のヘパリンの親和性により上澄みでバキュロ ウイルス粒子を結合するヘパリンの列に読み込まれます。列は汚染物質を除去するためのバッファーで洗浄、バキュロ ウイルスは高塩バッファーを持つ列から溶離されます。溶出液が等張液の塩濃度に希釈され、バキュロ ウイルス粒子がさらに遠心を使用して集中しています。このメソッドを使用して、バキュロ ウイルス感染粒子の 25% 回復を 500-fold まで集中してすることができます。ただし、ここで説明されているプロトコルは、1 L までの文化から生産と精製、バキュロ ウイルスを示します、メソッドできますがスケール アップ遺伝子治療応用のための臨床グレードのベクトル生成閉鎖系の培養における。
Introduction
バキュロ ウイルスは主に組換えタンパク質とチョウ目ハスモンヨトウ fugiperda (Sf) 9 でワクチンの生産の使用組換えハイブリッドバキュロとmulticapsid の核多角体病ウイルス (AcMNPV) を用いた昆虫細胞1,2,3,4. もっと最近、遺伝子療法アプリケーション5の有望なベクトルとして浮上しています。幅広いホストおよび組織の親和性を持っている知られているし、静止して増殖細胞に感染して、非病原性はホスト染色体4,5,6には統合されていません。また、スケーラブルでありクローズド システムの将来の臨床生産1の処理は、無血清浮遊培養でバキュロ ウイルスを生成できます。
バキュロ ウイルス粒子の純度は細胞毒性7,8,9を最小限に抑えながら効果的な伝達を達成するために重要です。バキュロ ウイルスは、遠心または接線流ろ過 (TFF) 伝染性の影響は限定的で集中することができます。しかし、これらの手順だけでなくウイルス粒子を集中、また細胞の残骸と Sf9 から蛋白質文化、毒性の in vitro (個人的な観察) できるし、炎症や使用する免疫反応を引き起こす可能性があります生体内で。ウイルス株を集中して高度な場合は特に、これを避けるため、バキュロ ウイルス感染を精製し、粒子を汚染から分離する必要があります。
いくつかの方法は、バキュロ ウイルスのベクトル10、11,12の濃縮精製に報告されています。使用可能なアプローチのヘパリン アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーは低濃度タンパク質12を汚染の浄化のシングル ステップの高レベルのことができます。メソッドは、バキュロ ウイルス13,14の受容体としてのヘパラン硫酸の同定に基づいています。列とバキュロ ウイルスのバインディングに Sf9 細胞上清をロードした後列は非連結またはゆるく縛られた汚染粒子を除去する生理学的な (等張性) バッファーで洗浄できます。ヘパリンへのバインドはリバーシブルなのでバキュロ ウイルス粒子は不活性化を防ぐために生理学的 (等張性) 塩濃度に希釈はしてすぐに浸透衝撃12高 salt のバッファーで溶出することができます。また、上のキャプチャと同様に、バキュロ ウイルスの生産とクロマトグラフィー カラムからの溶出実行できます現在の優れた製造基準 (cGMP) に互換性のあるクローズド システム プロセスを使用しています。
ここでは、製造、精製、およびアフィニ ティー ・ クロマトグラフィーおよび遠心分離を用いた感染バキュロ ウイルスの濃度の詳細なプロトコルを提供します。簡単に言えば、付着性文化のバキュロ ウイルス プラスミッド DNA と Sf9 細胞のトランスフェクションによってバキュロ ウイルスを制作・無血清培養で感染バキュロ ウイルスをさらに拡大します。我々 はヘパリン親和性クロマトグラフィーを用いたバキュロ ウイルスを浄化し、高い遺伝子治療用ベクターを集中する最後のステップとして遠心を使用します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで提示されたプロトコルでは、Sf9 細胞懸濁培養におけるバキュロ ウイルスの生産とヘパリン親和性クロマトグラフィーを用いたバキュロ ウイルスの精製をについて説明します。このプロトコルで使用されるパラメーターは収量を最大化し、感染バキュロ ウイルスの不活性化を最小限に抑えます。ここで提供されるプロトコルは、9他の人が達成したバキュロ ウイルス?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は一部で、スタートアップ資金援助によって支えシンシナティ小児研究財団 (CCRF) から m. n.、革新的なコア付与 (ICG) の下で健康の国民の協会の進めるトランスレーショナル科学センターでサポートされています。受賞番号 UL1 TR001425。 内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。
Materials
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
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