जीन थेरेपी आवेदन के लिए Baculovirus का उत्पादन एवं शुद्धिकरण
Summary
इस प्रोटोकॉल में, baculovirus Sf9 कोशिकाओं में baculovirus प्लाज्मिड के क्षणिक अभिकर्मक द्वारा उत्पादित और एक सीरम मुक्त निलंबन संस्कृति में परिवर्धित है । supernatant हेपरिन अपनत्व क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध है और आगे ultracentrifugation द्वारा ध्यान केंद्रित । इस प्रोटोकॉल के उत्पादन और जीन थेरेपी आवेदन के लिए baculovirus के शोधन के लिए उपयोगी है ।
Abstract
Baculovirus परंपरागत रूप से रिकॉमबिनेंट प्रोटीन और वैक्सीन के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया गया है । हालांकि, हाल ही में, baculovirus जीन थेरेपी आवेदन के लिए एक होनहार वेक्टर के रूप में उभर रहा है । यहाँ, baculovirus bacmid कोशिकाओं की एक अनुयाई संस्कृति में baculovirus प्लाज्मिड डीएनए (Sf9) के क्षणिक अभिकर्मक द्वारा उत्पादित है. Baculovirus बाद में Sf9 कोशिकाओं में एक सीरम मुक्त निलंबन संस्कृति में विस्तारित है जब तक वांछित मात्रा प्राप्त की है । इसके बाद हेपरिन अपनत्व क्रोमैटोग्राफी का प्रयोग कर संस्कृति supernatant से शुद्ध होती है. वायरस supernatant हेपरिन कॉलम पर लोड किया जाता है जो हेपरिन के लिए baculovirus के संबधों के कारण supernatant में baculovirus कणों को बांधता ग्लाइकोप्रोटीन ढंक देता है । स्तंभ एक बफ़र के साथ दूषित पदार्थों को निकालने के लिए धोया जाता है और baculovirus एक उच्च-लवण बफ़र के साथ स्तंभ से eluted है । eluate एक isotonic नमक एकाग्रता और baculovirus कणों को पतला है आगे ultracentrifugation का उपयोग कर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं । इस विधि का उपयोग करना, baculovirus को केंद्रित किया जा सकता है 500-संक्रामक कणों की एक 25% की वसूली के साथ गुना । हालांकि प्रोटोकॉल यहां वर्णित उत्पादन और संस्कृतियों से baculovirus के शुद्धि 1 एल को दर्शाता है, विधि स्केलed किया जा सकता है एक बंद प्रणाली निलंबन संस्कृति में एक नैदानिक उत्पादन के लिए जीन थेरेपी आवेदन के लिए ग्रेड सदिश ।
Introduction
Baculovirus मुख्य रूप से fugiperda रिकॉमबिनेंट Autographa californica नाभिकीय multicapsid वायरस (पॉलीहेड्रोसिस) का उपयोग करके lepidopteran धब् AcMNPV (एस एफ) 9 कीट कोशिकाओं में रिकॉमबिनेंट प्रोटीन और टीकों के उत्पादन के लिए प्रयोग किया जाता है 1 , 2 , 3 , 4. हाल ही में, यह जीन थेरेपी आवेदन5के लिए एक होनहार वेक्टर के रूप में उभर रहा है । यह एक व्यापक मेजबान और ऊतक tropism के लिए जाना जाता है, दोनों quiescent और proliferating कोशिकाओं को संक्रमित, गैर रोगजनक है, और मेजबान गुणसूत्र4,5,6में एकीकृत नहीं करता है । इसके अलावा, baculovirus सीरम मुक्त निलंबन संस्कृति है जो स्केलेबल है और भविष्य नैदानिक उत्पादन1के लिए बंद प्रणाली प्रसंस्करण के लिए अनुमति देता है में उत्पादित किया जा सकता है ।
cytotoxicity7,8,9को कम करते हुए प्रभावी transduction प्राप्त करने के लिए baculovirus कणों की शुद्धता महत्वपूर्ण है । Baculovirus अपने infectivity पर सीमित प्रभाव के साथ ultracentrifugation या स्पर्श प्रवाह निस्पंदन (TFF) द्वारा केंद्रित किया जा सकता है । हालांकि, इन प्रक्रियाओं को न केवल वायरस के कणों लेकिन यह भी सेलुलर मलबे और Sf9 संस्कृति है, जो इन विट्रो (व्यक्तिगत अवलोकन) में विषाक्त हो सकता है और सूजन या एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पैदा कर सकता है जब vivo मेंइस्तेमाल किया से प्रोटीन ध्यान । इस से बचने के लिए, विशेष रूप से जब अत्यधिक केंद्रित वायरस शेयरों का उपयोग, संक्रामक baculovirus की जरूरत है और शुद्ध कणों से अलग किया ।
कई तरीकों की शुद्धि और एकाग्रता के लिए सूचित किया गया है baculovirus वैक्टर10,11,12। उपलब्ध दृष्टिकोणों में से, हेपरिन संबध क्रोमैटोग्राफी एक एकल कदम प्रदूषित प्रोटीन के कम एकाग्रता के साथ शुद्धि के उच्च स्तर के लिए अनुमति देता है12. विधि baculovirus13,14के लिए रिसेप्टर के रूप में heparan सल्फेट की पहचान पर आधारित है । कॉलम और baculovirus के बंधन पर Sf9 सेल supernatant लोड करने के बाद, कॉलम शारीरिक (isotonic) बफर के साथ धोया जा सकता है असीम या ढीले रूप से बाध्य दूषित कणों को दूर । हेपरिन के लिए बाध्यकारी के बाद से प्रतिवर्ती है, baculovirus कणों एक उच्च नमक बफर के साथ eluted जा सकता है, जो तुरंत शारीरिक (isotonic) नमक एकाग्रता के लिए पतला है आसमाटिक सदमे से रोकने के लिए12। इसके अलावा, baculovirus के उत्पादन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पर कब्जा और क्रोमैटोग्राफी कॉलम से रेफरेंस, एक बंद प्रणाली प्रक्रिया है जो वर्तमान अच्छा विनिर्माण प्रथाओं (cGMP) के साथ संगत है का उपयोग किया जा सकता है ।
यहां, हम निर्माण, शुद्धि, और संक्रामक baculovirus की एकाग्रता के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान संबध क्रोमैटोग्राफी और केंद्रापसारक का उपयोग कर । संक्षेप में, हम प्लाज्मिड संस्कृति में एक baculovirus अनुयाई डीएनए के साथ Sf9 कोशिकाओं के अभिकर्मक द्वारा baculovirus उत्पादन और आगे सीरम मुक्त निलंबन संस्कृति में संक्रामक baculovirus का विस्तार । हम हेपरिन संबध क्रोमैटोग्राफी का उपयोग baculovirus शुद्ध और अंतिम चरण के रूप में उपयोग ultracentrifugation के लिए अत्यधिक जीन थेरेपी आवेदन के लिए वेक्टर ध्यान केंद्रित ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल में Sf9 कोशिकाओं में baculovirus के उत्पादन का वर्णन है जो निलंबन संस्कृति और baculovirus के शुद्धिकरण में एक हेपरिन संबध क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर रहा है. इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए गए पैराम?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के भाग में सिनसिनाटी चिल्ड्रन रिसर्च फाउंडेशन (CCRF) से M.N. और अभिनव कोर ग्रांट (ICG) के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुवाद विज्ञान को आगे बढ़ाने के लिए राष्ट्रीय केंद्र द्वारा समर्थित शुरू से धन का समर्थन किया है पुरस्कार संख्या UL1 TR001425. सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिंमेदारी है और जरूरी नहीं कि स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के सरकारी विचारों का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
Materials
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
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