Produktion och rening av baculoviridae för genterapi ansökan
Summary
I detta protokoll, baculoviridae produceras av övergående transfection av baculoviridae plasmid i Sf9 celler och förstärks i en serumfritt suspension kultur. Supernatanten renas av heparin affinitetskromatografi och ytterligare koncentrerad genom ultracentrifugering. Detta protokoll är användbar för produktion och rening av baculoviridae för gen terapi program.
Abstract
Baculoviridae har traditionellt använts för produktion av rekombinant protein och vaccin. Mer nyligen, baculoviridae framstår dock som en lovande vektor gen terapi program. Här produceras baculoviridae av övergående transfection av baculoviridae plasmiden DNA (bacmid) i en vidhäftande kultur Sf9 celler. Baculoviridae utökas därefter Sf9 celler i ett serumfritt suspension kultur tills önskad volym erhålls. Det renas sedan från kulturen supernatanten med heparin affinitetskromatografi. Virus supernatant är lastades på kolumnen heparin som binder baculoviridae partiklar i supernatanten på grund av heparin för baculoviridae omsluta glykoprotein. Kolumnen är tvättad med en buffert för att avlägsna föroreningar och baculoviridae elueras från kolonnen med en hög-salt-buffert. Eluatet är utspätt till en isoton salt koncentration och baculoviridae partiklarna är ytterligare koncentrerad använder ultracentrifugering. Med den här metoden kan baculoviridae koncentreras upp till 500 med en 25% återvinning av infektiös partiklar. Även om protokollet beskrivs här visar produktion och rening av baculoviridae från kulturer upp till 1 L, metoden kan skalas upp i en stängd-systemet suspension kultur att producera en klinisk-grade vektor för gen terapi program.
Introduction
Baculoviridae används främst för produktion av rekombinanta proteiner och vacciner i fjärilsarts Spodoptera fugiperda (Sf) 9 insekt celler med hjälp av rekombinant Autographa californica multicapsid nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) 1 , 2 , 3 , 4. mer nyligen, det framstår som en lovande vektor för gen terapi program5. Det är känt för att ha en bred värd och vävnad tropism, infekterar både quiescent och prolifererande celler, är icke-patogena och integrera inte i värd kromosom4,5,6. Dessutom kan baculoviridae produceras i serumfritt suspension kultur som är skalbar och möjliggör slutet system bearbetning för framtida kliniska produktion1.
Renheten i baculoviridae partiklar är viktigt för att uppnå effektiv transduktion samtidigt minimera cytotoxicitet7,8,9. Baculoviridae kan koncentreras genom ultracentrifugering eller tangentiell flow filtration (TFF) med begränsad inverkan på sin smittsamhet. Dessa förfaranden inte bara koncentrera viruspartiklar men också cellulära skräp och proteiner från Sf9 kultur, som kan vara giftiga i vitro (personlig observation) och kan framkalla inflammation eller ett immunsvar när den används i vivo. För att undvika detta, särskilt när använder mycket koncentrerad viruslagren, måste infektiös baculoviridae renas och separerade från att förorena partiklar.
Flera metoder har rapporterats för rening och koncentration av baculoviridae vektorer10,11,12. Av de tillgängliga metoderna möjliggör heparin affinitetskromatografi steg hög rening med den låga koncentrationen av kontaminerande proteiner12. Metoden bygger på identifiering av heparansulfat sulfat som receptorn för baculoviridae13,14. Efter lastning Sf9 cell supernatanten på kolumn och bindning av baculoviridae, kan kolumnen tvättas med fysiologisk (isoton) buffert att ta bort obundna eller löst bundna förorenande partiklar. Eftersom bindningen till heparin är reversibel, kan baculoviridae partiklar vara elueras med en hög salt bufferten, vilket späds omedelbart till fysiologisk (isoton) salt koncentration att förhindra inaktivering av osmotiska chock12. Dessutom kan produktion av baculoviridae, liksom fånga på och eluering från kolumnen kromatografi utföras med en stängd-system process som är kompatibel med nuvarande god tillverkningssed (cGMP).
Här, ger vi ett detaljerat protokoll för tillverkning, rening, och koncentrationen av infektiös baculoviridae använder affinitetskromatografi och centrifugering. Kort, vi producerar baculoviridae av transfection Sf9 celler med en baculoviridae plasmid DNA i vidhäftande kultur och ytterligare utöka de smittsamma baculoviridae i serumfritt suspension kultur. Vi rena baculoviridae använder heparin affinitetskromatografi och använda ultracentrifugering som det sista steget mycket koncentrera vektorn för gen terapi program.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det protokoll som presenteras här beskrivs produktionen av baculoviridae Sf9 celler i suspension kultur och rening av baculoviridae använder en heparin affinitetskromatografi. De parametrar som används i detta protokoll maximera avkastningen och minimera inaktivering av infektiös baculoviridae. Protokollet anges här visar en betydligt förbättrad återhämtning av baculoviridae partiklar jämfört med återvinningar uppnåtts av andra9.
På grund av bred värd utb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds delvis av den startfinansiering från Cincinnati Children’s Research Foundation (CCRF) att M.N. och innovativa Core Grant (ICG) stöds av National Center för framflyttning translationell vetenskaper av National Institutes of Health under Award nummer UL1 TR001425. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health.
Materials
| Akta Avant 150 | GE Healthcare | 28976337 | Chromatography system |
| POROS Heparin 50 µm Column | ThermoFisher Scientific | 4333414 | Heparin column |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | Non-catalog item | Concentrates virus at high-speed |
| Polyallomer Ultracentrifuge tube | Beckman-Coulter | 326823 | Concentrates virus at high-speed |
| MaxQ 8000 orbital shaker incubator | ThermoFisher Scientific | Non-catalog item | Shaker for suspension culture |
| 250 mL Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238071 | Flask for suspension culture |
| 1 L Erlenmeyer flasks | ThermoFisher Scientific | 238072 | Flask for suspension culture |
| Microscope (Olympus CKX41) | Olympus | Non-catalog item | Cell monitoring and counting |
| Table top centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75253839/433607 | For clarification of Baculovirus supernatant |
| 50 ml Conical tube | ThermoFisher Scientific | 14-959-49A | For collection of Baculovirus supernatant |
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 07-200-80 | Tissue culture treated plate |
| 10-cm plate | ThermoFisher Scientific | 08-772E | Tissue culture treated plate |
| Stericup-HV, 0.45 µm, PVDF | EMD-Millipore | SCHVU05RE | Filtration unit |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | 15160-054 | |
| Tetracycline | Sigma-Aldrich | T7660 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| Bac-to-Bac Vector Kit | ThermoFisher Scientific | 10360-014 | Baculovirus expression system |
| DH10B-T1R Competent cell | ThermoFisher Scientific | 12331-013 | Competent cell for bacmid |
| TE buffer | In-house | Non-catalog item | 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0. |
| Plasmid Maxiprep kit | ThermoFisher Scientific | K2100-06 | For bacmid purification |
| Sf9 Cells | ThermoFisher Scientific | 11496-015 | Insect cells |
| Grace’s Insect Cell Culture Medium | ThermoFisher Scientific | 11605-094 | Transfection medium |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 20012227 | Washing cells, diluting samples |
| HyClone SFX-Insect cell media | GE Healthcare | SH30278.02 | Serum-free insect cell growth medium |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Enzyme to degrade DNA and RNA |
| Baculovirus plasmid (bacmid) DNA | In-house | Non-catalog item | Bacmid for Baculovirus Production |
| Cellfectin II | ThermoFisher Scientific | 10362 | Transfection reagent for insect cells |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4737 | Stabilizes Baculovirus |
| Cryovial | Thomas Scientific | 1222C24 | For storage of Baculovirus |
| HT1080 cell line | ATCC | CCL-121 | Fibroblast cell line |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | Growth media for cell lines |
| Wash buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 150 mmol/l sodium chloride |
| Elution buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 1.5 mol/l sodium chloride |
| Column cleaning buffer | In-house | Non-catalog item | 20 mmol/l phosphate buffer containing 2.0 mol/l sodium chloride |
| Sterile water | In-house | Non-catalog item | For Akta Avant cleaning |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.09137 | For Akta Avant cleaning |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7073 | For Akta Avant cleaning |
References
- Ikonomou, L., Schneider, Y. J., Agathos, S. N. Insect cell culture for industrial production of recombinant proteins. Appl Microbiol Biotechnol. 62 (1), 1-20 (2003).
- Contreras-Gomez, A., Sanchez-Miron, A., Garcia-Camacho, F., Molina-Grima, E., Chisti, Y. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol Prog. 30 (1), 1-18 (2014).
- Cox, M. M. Recombinant protein vaccines produced in insect cells. Vaccine. 30 (10), 1759-1766 (2012).
- Boyce, F. M., Bucher, N. L. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (6), 2348-2352 (1996).
- Airenne, K. J., et al. Baculovirus: an insect-derived vector for diverse gene transfer applications. Mol Ther. 21 (4), 739-749 (2013).
- Sung, L. Y., et al. Efficient gene delivery into cell lines and stem cells using baculovirus. Nat Protoc. 9 (8), 1882-1899 (2014).
- Zeng, J., Du, J., Lin, J., Bak, X. Y., Wu, C., Wang, S. High-efficiency transient transduction of human embryonic stem cell-derived neurons with baculoviral vectors. Mol Ther. 17 (9), 1585-1593 (2009).
- Zeng, J., Du, J., Zhao, Y., Palanisamy, N., Wang, S. Baculoviral vector-mediated transient and stable transgene expression in human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (4), 1055-1061 (2007).
- Wu, C., Soh, K. Y., Wang, S. Ion-exchange membrane chromatography method for rapid and efficient purification of recombinant baculovirus and baculovirus gp64 protein. Hum Gene Ther. 18 (7), 665-672 (2007).
- Grein, T. A., Michalsky, R., Vega Lopez, M., Czermak, P. Purification of a recombinant baculovirus of Autographa californica M nucleopolyhedrovirus by ion exchange membrane chromatography. J Virol Methods. 183 (2), 117-124 (2012).
- Nasimuzzaman, M., Lynn, D., van der Loo, J. C., Malik, P. Purification of baculovirus vectors using heparin affinity chromatography. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16071 (2016).
- Makkonen, K. E., Turkki, P., Laakkonen, J. P., Yla-Herttuala, S., Marjomaki, V., Airenne, K. J. 6-o- and N-sulfated syndecan-1 promotes baculovirus binding and entry into Mammalian cells. J Virol. 87 (20), 11148-11159 (2013).
- Nasimuzzaman, M. Heparan sulfate in baculovirus binding and entry of mammalian cells. J Virol. 88 (8), 4607-4608 (2014).
- Urabe, M., et al. Scalable generation of high-titer recombinant adeno-associated virus type 5 in insect cells. J Virol. 80 (4), 1874-1885 (2006).
- Feliciello, I., Chinali, G. A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli. Anal Biochem. 212 (2), 394-401 (1993).
- Nasimuzzaman, M., Persons, D. A. Cell Membrane-associated heparan sulfate is a receptor for prototype foamy virus in human, monkey, and rodent cells. Mol Ther. 20 (6), 1158-1166 (2012).
- Earl, P. L., Americo, J. L., Moss, B. Development and use of a vaccinia virus neutralization assay based on flow cytometric detection of green fluorescent protein. J Virol. 77 (19), 10684-10688 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Suppression of tumor growth in xenograft model mice by programmed cell death 4 gene delivery using folate-PEG-baculovirus. Cancer Gene Ther. 17 (11), 751-760 (2010).
- Stanbridge, L. J., Dussupt, V., Maitland, N. J. Baculoviruses as vectors for gene therapy against human prostate cancer. J Biomed Biotechnol. 2003 (2), 79-91 (2003).
- Nasimuzzaman, M., et al. Production and purification of high-titer foamy virus vector for the treatment of leukocyte adhesion deficiency. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16004 (2015).
