मानव टेलोमिरेज रिवर्स transcriptase (TERT) न केवल telomeric डीएनए बल्कि आरएनए-निर्भर आरएनए पोलीमरेज़ गतिविधि के माध्यम से भी डबल-कतरा आरएनए । यहां, हम अंतर्जात TERT की आरएनए-निर्भर आरएनए पोलीमरेज़ गतिविधि का पता लगाने के लिए एक नव स्थापित परख का वर्णन ।
मानव टेलोमिरेज रिवर्स transcriptase (TERT) टेलोमिरेज की उत्प्रेरक उप इकाई है, और यह आरएनए-निर्भर डीएनए telomere गतिविधि के माध्यम से पोलीमरेज़ के बढ़ाव । हालांकि TERT एक रिवर्स transcriptase के रूप में नाम है, TERT के संरचनात्मक और वंशावली विश्लेषण प्रदर्शित करता है कि TERT सही हाथ polymerases का एक सदस्य है, और वायरल आरएनए-निर्भर आरएनए polymerases (RdRPs) के साथ ही वायरल रिवर्स transcriptase से संबंधित है । हम सबसे पहले मानव TERT की RdRP गतिविधि की पहचान की है कि पूरक आरएनए एक गैर कोडिंग आरएनए के लिए खड़े हो जाओ और कैंसर की कोशिकाओं में आरएनए मुंह बंद करने में योगदान करता है । इस गैर-विहित एंजाइमी गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए, हम २००९ में रिकॉमबिनेंट TERT के साथ RdRP परख विकसित की है, इसके बाद इन विट्रो में स्थापित RdRP अंतर्जात के लिए परख TERT । इस पांडुलिपि में, हम उत्तरार्द्ध विधि का वर्णन । संक्षेप में, TERT प्रतिरक्षा परिसरों कोशिकाओं से अलग कर रहे हैं, और RdRP प्रतिक्रिया के लिए रेडियोधर्मी rNTP सहित आरएनए और rNTPs टेम्पलेट के साथ मशीन । एकल असहाय आरएनए को खत्म करने के लिए, प्रतिक्रिया उत्पादों RNase मैं के साथ इलाज कर रहे हैं, और अंतिम उत्पादों polyacrylamide जेल ट्रो के साथ विश्लेषण कर रहे हैं । Radiolabeled RdRP उत्पादों autoradiography द्वारा रातोंरात जोखिम के बाद पता लगाया जा सकता है ।
मानव टेलोमिरेज रिवर्स transcriptase (TERT) अच्छी तरह से टेलोमिरेज के उत्प्रेरक उप इकाई के रूप में जाना जाता है, और यह telomere आरएनए घटक (टेलोमिरेज), विशिष्ट आरएनए1टेम्पलेट का उपयोग TERC के बढ़ाव । हालांकि TERT polymerizes telomeric डीएनए टेलोमिरेज के एक घटक के रूप में, संरचनात्मक और वंशावली विश्लेषण संकेत मिलता है कि TERT बारीकी से वायरल आरएनए-निर्भर आरएनए polymerases (RdRPs) के साथ-साथ वायरल रिवर्स transcriptase, और शेयर डोमेन के साथ संबंधित है ये polymerases2,3,4. RdRP एंजाइम कि पूरक आरएनए एक टेम्पलेट आरएनए के लिए किनारा उत्पन्न करता है. एंजाइम न केवल वायरस में, लेकिन यह भी संयंत्र, खमीर और कीड़ा के रूप में मॉडल जीवों में इनकोडिंग है, और RdRP द्वारा डबल-असहाय आरएनए संश्लेषण transcriptional के लिए योगदान देता है और पोस्ट-transcriptional जीन मुंह बंद करने इन जीवों में5,6 . हालांकि मानव RdRP एक लंबे समय के लिए याद किया गया था, हम २००९7में मानव TERT में RdRP गतिविधि पाया ।
हम पहले रिकॉमबिनेंट प्रोटीन7के साथ TERT के RdRP गतिविधि की पुष्टि की है, तो इन विट्रो परख में एक संवेदनशील स्थापित करने के लिए अंतर्जात TERT8RdRP गतिविधि का पता लगाने । यहां, हम में प्रदर्शन इन विट्रो RdRP परख (आईपी-RdRP परख) अंतर्जात TERT के लिए । इस विधि अंतर्जात TERT के immunoprecipitation (आईपी) के साथ शुरू होता है, और इन विट्रो RdRP प्रतिक्रिया, जिसमें रेडियोधर्मी ribonucleotides नवजात आरएनए किस्में में शामिल कर रहे हैं द्वारा पीछा किया ।
आईपी-RdRP परख मानव TERT के RdRP गतिविधि का पता लगाने के लिए एक संवेदनशील तरीका है । TERT प्रोटीन अत्यधिक mitotic हेला कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, जिसमें TERT रूपों RdRP परिसर में8,9,10. यह पता चलता है कि mitotic हेला कोशिकाओं RdRP गतिविधि का पता लगाने के लिए एक इष्टतम सामग्री हैं । ऊपर बताए गए प्रोटोकॉल में, mitotic और ग़ैर-सिंक्रनाइज़्ड हेला कक्षों को क्रमशः धनात्मक और ऋणात्मक उदाहरण के रूप में शामिल किया गया है. के रूप में चित्रा 1aमें दिखाया गया है, mitotic हेला कोशिकाओं में अनुशंसित आरएनए टेम्पलेट से RdRP परख उत्पादों 20 से 30 nt के बीच व्यापक रेडियोधर्मी संकेतों को दिखाने. हेला कोशिकाओं के अलावा, हम सेल लाइनों के विभिंन प्रकार के साथ परख प्रदर्शन किया है, और पाया कि संकेत पैटर्न विभिंन प्रकार के सेल में परिवर्तित किया जा सकता है9: कुछ केवल 30 nt के आसपास एक मजबूत संकेत दिखाने के लिए, कुछ हेला कोशिकाओं के साथ एक समान पैटर्न दिखाओ । हम भी आरएनए के साथ परख प्रदर्शन किया है ३४ nt टेंपलेट8, लघु और लंबी (~ ३०० nt) विभिंन दृश्यों के साथ RNAs के अलावा अंय टेंपलेट्स, और सफलतापूर्वक उन टेंपलेट्स से RdRP उत्पादों को प्राप्त यद्यपि वहां कुछ वरीयता हो सकती है । पहले परीक्षण के लिए, तथापि, हम mitotic चरण और ३४ nt आरएनए टेम्पलेट में हेला कोशिकाओं का उपयोग करने की सलाह देते हैं । RdRPs दोनों एक प्राइमरी में और एक प्राइमरी-स्वतंत्र तरीके से11में, दो असहाय आरएनए उत्पंन कर सकते हैं । हमने बताया है कि TERT मानव RdRP7,9के रूप में इस संपत्ति को बरकरार रखता है; TERT एक आरएनए टेम्पलेट से dsRNA 3 ‘-foldback संरचना के साथ एक पीठ भड़काना तंत्र7के माध्यम से । ३४ nt आरएनए टेम्पलेट के लिए, TERT9प्राइमर का उपयोग किए बिना पूरक किस्में संश्लेषित । विशेष रूप से एक प्राइमर में संश्लेषित RdRP उत्पादों का पता लगाने के लिए-स्वतंत्र तरीके से, यानी डे नोवो संश्लेषित आरएनए उत्पादों, [α-३२p] NTP के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता [γ-३२P] NTP में RdRP प्रतिक्रिया9.
मोतियों पर TERT प्रतिरक्षा परिसरों के MNase उपचार वांछित परिणाम प्राप्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । यदि MNase उपचार भी लंबे समय या गहन मिलाते के साथ प्रदर्शन किया है, RdRP उत्पादों उल्लेखनीय कम हो जाएगा । ऐसी मुसीबत से बचने के लिए, हम दृढ़ता से कड़ाई से प्रोटोकॉल का पालन सावधानी से करने की सलाह देते हैं । HMD समाधान सफलता के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक है । यदि आप पाते है कि संकेत बहुत कमजोर हैं, एक नए तैयार एक के लिए HMD समाधान की जगह ।
प्रोटोकॉल के दौरान, एक RNase संदूषण से बचने के लिए बहुत ध्यान रखना चाहिए । Ribonuclease उपचार समर्पित उपकरणों के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए । Ribonuclease जोड़ तोड़ के बाद, एक युक्तियां और RNase के साथ ट्यूबों तुरंत त्यागना चाहिए, विशेष समाधान के साथ RNase को खत्म (जैसे RNase चुप), और परिवर्तन पेड़ों ।
TERT न केवल TERC बल्कि अंतर्जात RNAs के कई प्रकार के साथ इंटरैक्ट करता है, और हम7उनमें से भाग की सूचना दी है । आईपी में संशोधन-RdRP परख, जैसे MNase उपचार के बिना RdRP परख, अंतर्जात आरएनए की पूरी सूची प्रदान करेगा TERT-संबद्ध RdRP गतिविधि और उनके अनुक्रम सुविधाओं पर bioinformatic गाइड के लिए टेंपलेट्स । हमने इस प्रोटोकॉल को टिशू lysate में सफलतापूर्वक लागू किया है । क्योंकि TERT सामांय और ट्यूमर के ऊतकों की एक किस्म में व्यक्त की है, इस परख के लिए गैर मानव में TERT के विहित एंजाइमी समारोह की जांच उपयोगी हो सकती है ।
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना के हिस्से में कैंसर चिकित्सकीय (पी-प्रत्यक्ष) (15cm0106102h0002,. एम.) और कैंसर अनुसंधान और चिकित्सीय विकास के लिए परियोजना (पी बनाने) (16cm01061150001,. एम.) पर जापान की एजेंसी से अभिनव अनुसंधान के विकास के लिए प्रोजेक्ट द्वारा समर्थित किया गया चिकित्सा अनुसंधान और विकास के लिए, एमएड; टाकेडा विज्ञान फाउंडेशन (Y.M.); राजकुमारी Takamatsu कैंसर रिसर्च फंड (13-24520, Y.M.) का अनुदान; और JSPS KAKENHI अनुदान संख्या JP16K07133 (Y.M.) ।
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Wako | 044-29765 | |
Fetal bovine serum (FBS) | CORNING | 35-010-CV | |
Penicillin-Streptomycin mixed solution | nacalai tesque | 26253-84 | |
Trypsin-Ethylenediamenetetraacetic acid (EDTA) solution | nacalai tesque | 32777-44 | |
Phosphate buffered saline (PBS(-)) | Wako | 166-23555 | |
Thymidine | nacalai tesque | 07147-61 | |
Nocodazole | Sigma | M1404 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | nacalai tesque | 08904-85 | |
Sodium chloride | nacalai tesque | 31333-45 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | nacalai tesque | 35434-21 | |
Hydrochloric acid | nacalai tesque | 18321-05 | |
Nonidet P-40 (NP-40) | nacalai tesque | 25223-04 | |
Pierce Protein A Plus Agarose | Thermo scientific | 22812 | |
2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES) | nacalai tesque | 17514-15 | |
Potassium hydroxide | Wako | 168-21815 | |
Potassium acetate | nacalai tesque | 28405-05 | |
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2•6H2O) | Wako | 135-00165 | |
Glycerol | nacalai tesque | 17045-65 | |
Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether (Triton X-100) | Wako | 169-21105 | |
cOmplete, EDTA-free | Roche Applied Science | 11 873 580 001 | |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2•2H2O) | nacalai tesque | 06731-05 | |
Micrococcal nuclease (MNase) | Takara Bio | 2910A | |
Ethylene glycol bis (b-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | nacalai tesque | 15214-92 | |
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS) | nacalai tesque | 07957-64 | |
Dithiothreitol (DTT) | nacalai tesque | 14128-91 | |
rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM each | Promega | E6000 | |
[a-32P]UTP (3,000 Ci/mmol) | PerkinElmer | NEG507H | Use fresh RI for the assay |
RNase inhibitor | TOYOBO | SIN-201 | |
Proteinase K | Takara | 9033 | |
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Life Technologies | AM9720 | |
3 M Sodium acetate | NIPPON GENE | 316-90081 | |
Ethanol (99.5) | nacalai tesque | 14713-95 | |
Dr. GenTLE Precipitation Carrier | Takara Bio | 9094 | |
RNase One Ribonuclease | Promega | M4265 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | nacalai tesque | 02873-75 | |
Formamide, deionized | nacalai tesque | 16345-65 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (EDTA) | nacalai tesque | 15130-95 | |
Orange G | nacalai tesque | 25401-22 | |
CO2 incubator | e.g., ASTEC | SCA-325DRS | |
Centrifuge | e.g., TOMY | EX-135 | For step B) |
Micro refrigerated centrifuge | e.g., KUBOTA | 3740 | For step 6.2 |
Sonicator | Qsonica | Q125 | Set a microtip (#4422) on the sonicator, for step 6.4 |
Micro refrigerated centrifuge | e.g., TOMY | MX-305 | For step 6.5 |
Cooled incubator | e.g., Panasonic | MIR-154-PJ | Set a rotary shaker inside |
Rotary shaker | e.g., TAITEC | RT-5 | |
Cooled incubator | e.g., TAITEC | BR-43FL | Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 7.7 |
MINI WAVE | AS ONE | WEV-03 | A shaker for steps 7.7, 8.5 and 8.6 |
Incubator | e.g., TAITEC | HB-80 | Set a shaker “MINI WAVE” inside, for step 8.5 and 8.6 |
Block incubator | e.g., ASTEC | BI-516S |