En optimerad Evans blå protokoll att bedöma vaskulär läckage i musen
Summary
I den här artikeln beskrivs ett ekonomiskt, optimerad och enkel protokoll som använder metoden Evans blått färgämne för att bedöma plasma extravasering i organ av FVBN möss som kan anpassas för användning i andra stammar, arter, och andra organ eller vävnader.
Abstract
Vaskulär läckage eller plasma extravasering, har ett antal orsaker, och kan vara en allvarlig konsekvens eller symptom på ett inflammatoriskt svar. Denna studie kan i slutändan leda till ny kunskap om orsakerna till eller nya sätt att hämma eller behandla plasma extravasering. Det är viktigt att forskare har rätt verktyg, inklusive de bästa metoderna som finns, för att studera plasma extravasering. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll, metoden Evans blått färgämne, för att bedöma plasma extravasering i organ av FVBN möss. Detta protokoll är avsiktligt enkelt, till lika stor en grad som möjligt, innehåller men data av hög kvalitet. Evans blå färg har valts främst eftersom det är lätt för genomsnittliga laboratoriet att använda. Vi har använt detta protokoll för att tillhandahålla bevis och stöd för hypotesen att de enzym neprilysin kan skydda vaskulatur mot plasma extravasering. Emellertid kan detta protokoll försöksvis användas och anpassas för användning i andra stammar av möss eller andra arter, i många olika organ eller vävnader, för studier som kan innefatta andra faktorer som är viktiga i förståelse, förebygga eller behandla plasma extravasering. Detta protokoll har optimerats på ett utförligt och modifierad från befintliga protokoll och kombinerar tillförlitlighet, enkel användning, ekonomi och allmän tillgänglighet av material och utrustning, att göra detta protokoll överlägsen för genomsnittliga laboratoriet att använda i kvantifiera plasma extravasering från organ.
Introduction
Vaskulär läckage i organ avser extravasering, eller läckage av blod plasma genom luckor tillverkas i endotel bokför kapillär venoler i organen. Denna plasma extravasering eller ökad vaskulär permeabilitet, som kan uppstå från någon typ av en inflammatorisk reaktion, kan få allvarliga konsekvenser. Det är därför viktigt att detta fenomen, dess orsaker, modulatorer och konsekvenser, studeras och förstås, och likaså att utredarna har bra verktyg och protokoll att studera dem. Endothelial luckorna kan produceras via ett antal stimuli, men vanligtvis produceras av peptid signalsubstanser eller tachykininer på endothelia. En av de större naturligt förekommande mediatorer av denna process, vilket resulterar i ökad plasma extravasering, är den undecapeptide tachykinin neuropeptid, substans P1.
Metoder att undersöka och mäta vaskulär permeabilitet eller plasma extravasering, som använder egenskapen albuminbindning Evans blå färg, har utvecklats och är oftast kända för deras precision, enkelhet, ekonomi, säkerhet och möjligheten att tillåta det bestämning av plasma extravasering från flera vävnader på en gång, önskas om så2,3,4,5,6,7,8,9 . Detta Evans blå protokoll för att bedöma plasma extravasering i organ av FVBN möss använder alla dessa, men lägger till några viktiga ändringar som gör det generellt användbara och anpassningsbar för framtida studier, med den genomsnittliga laboratorium som utför eller kommer att genomföra viktiga studier av faktorer som förknippas med plasma extravasering eller vaskulär permeabilitet. I detta protokoll införs substans P till möss på 1 nmol per kg, vilket förstärker extravaseringen av plasma av 1.5-fold. Detta ökar känsligheten i protokollet, vilket resulterar i mer lätt observerbara och erhållas resultat. Andra faktorer som påverkar permeabilitet, såsom olika andra peptider, kemikalier eller vissa former av giftiga skada, får användas eller studerats av andra laboratorier, som önskat. Halsvenen injektioner används i detta protokoll att införa Evans blue och substans P systemiskt, som kräver terminal kirurgi. Emellertid, halsvenen injektioner5,7,10, även efter övervägande av de nödvändiga terminal kirurgiska teknikerna, är lättare att behärska och leda till produktion av mer enhetliga resultat än andra venös injektioner, inklusive svans ven injektioner4,9. Även om det kan vara möjligt för Evans blå levereras av retro-orbital vensinustrombos injektioner, har inga referenser i litteraturen hittats som använder denna metod för leverans av Evans blue. Men när det gäller svans ven injektioner begränsar den höga graden av expertis och övning att behärska reproducibly denna teknik kraftigt dess användning för framgångsrika Evans blå injektioner. Däremot erbjuder den alternativa halsvenen injektion metoden som beskrivs i våra protokoll, en tekniskt erhållas lösning. En avgörande förfarande för perfusion av musens vener, utförs precis efter offrandet av Evans blue-perfusion musen, tar bort överflödig Evans blå färgämnet och har standardiserats i detta protokoll. Tidigare beskrivna metoder för perfusion har noggrant granskats och modifierad för att erhålla förevarande förfarande. Andra ändringar som beskrivs här är alla optimerade, enkel och billig.
Det finns några viktiga begränsningar av metoden Evans blått färgämne. Till exempel låg känslighet ibland associerade med den här metoden kan förhindra att vissa ytterligare brutto patologiska och Histologisk undersökning av vävnader från Evans blue-injiceras djur. Dessa och andra begränsningar har dock lett till utvecklingen av alternativa metoder och modeller som, dock fortfarande använder Evans blå. Mätning av Evans blue av fluorescens (snarare än av visual-range) spektroskopi kan öka känsligheten för metoden. Dessutom utvecklades fluorescensmikroskopi av Evans blå-färgade vävnader för att möjliggöra observation av vaskulär läckage i mer distinkta platser11. Dessutom hela kroppen imaging och skanning av ett levande djur tidigare injiceras med Evans blå12 möjliggör undersökning av Evans blå koncentrationer på ett kontinuerligt sätt, snarare än på en specifik valt tid pekar av experimentet. Men den här metoden kräver tillgång till lämpliga faciliteter för imaging och kan bli mycket dyrt. Ändringar som rör Evans blue och utförs i en in vitro- typ av modell, har som i en cell kultur eller chick chorioallantoic modell13 (CAM) också beskrivits. Dessa modeller övervakas av fluorescens och intravital14 mikroskopi, och tillåter kvantifiering av vaskulär permeabilitet förändringar över tid, men kan ta upp frågor om korrekt modellering i vivo villkor och kan även dyra.
Det har förekommit andra metoder utvecklats för att bestämma och kvantifiera vaskulär läckage eller permeabilitet, som inte inbegriper förvaltning av Evans blå. Dessa metoder får anställa en lämplig fluorescerande molekyl (exempelvis albumin eller fluorescein), eller en isotopically märkta eller på annat sätt märkta molekyl, att levande djur (eller till cell kultur eller chorioallantoic (CAM) modeller13, följt av icke-invasiva Imaging (PET-kamerateknik, MRI, intravital mikroskopi, hela kroppen skanning) eller invasiva imaging (fluorescerande mikroskopi)3,12,15. Även om dessa tekniker kan erbjuda ett antal fördelar jämfört med andra Evans blå metoder, har de också nackdelar, vilket kan omfatta deras stora komplexitet, erforderlig expertis, resurser och höga monetära kostnader.
Neprilysin16 (peptidase enzymet NEP, även känd som CD10, MME eller enkefalinas) har föreslagits vara inblandade i att hämma plasma extravasering, åtminstone delvis, genom enzymatisk metabolism och inaktivering av endogen substans P. I vävnader som i cell surface-hämmare NEP uppstår, kan det således vara en försvagning av effekten av substans P, förmodligen av peptidase aktiviteten av NEP.
Inledningsvis testade vi för substans P-inducerad plasma extravasering utnyttja detta modifierade Evans blå protokoll, med FVBN vildtyp (WT) och NEP-knockoutmöss (KO). NEP inblandning i substans P-augmented plasma extravasering misstänktes från dessa inledande studier, och vi beskriva dessa och ytterligare experiment med NEPS roll i plasma extravasering. Fokus för detta manuskript är inte NEP eller dess roll i plasma extravasering, men snarare i plasma extravasering experimenterar själva. NEP resultaten är representativa för typ av resultat som kan erhållas genom användning av detta modifierade protokoll. Evans blå metoden att mäta plasma extravasering har optimerat och ändras, som beskrivs i detalj nedan för FVBN möss.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som diskuterats ovan, studiet av plasma extravasering kan i slutändan leda till ny kunskap om orsakerna till eller nya sätt att hämma eller behandla plasma extravasering. Lyckad användning av plasma extravasering protokollet (ovan), har med Evans blått färgämne, påvisats i det nuvarande manuskriptet. Även om data visas tillbaka hypotesen att NEP kan skydda vaskulatur mot plasma extravasering, detta är ett sekundärt mål för närvarande, med det primära målet är att presentera en optimerad protokollet som l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Andy Poczobutt och Dr Jori Leszczynski för deras värdefulla hjälp och ändringar till detta manuskript. Stöds av bidrag från nationella hjärta, lunga och Blood Institute (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 och RO3 HL095439) och den institutionen av Veterans’ Affairs (Merit Review).
Materials
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
References
- Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J. Substance P. Eur J Pain. 4 (2), 121-135 (2000).
- Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig skin. Int Arch Allergy Appl Immunol. 91 (3), 232-238 (1990).
- Szabo, A., Menger, M. D., Boros, M. Microvascular and epithelial permeability measurements in laboratory animals. Microsurgery. 26 (1), 50-53 (2006).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Moitra, J., Sammani, S., Garcia, J. G. Re-evaluation of Evans Blue dye as a marker of albumin clearance in murine models of acute lung injury. Transl Res. 150 (4), 253-265 (2007).
- Figini, M., et al. Substance P and bradykinin stimulate plasma extravasation in the mouse gastrointestinal tract and pancreas. Am J Physiol. 272 (4), 785-793 (1997).
- Awad, A. S., et al. Selective sphingosine 1-phosphate 1 receptor activation reduces ischemia-reperfusion injury in mouse kidney. Am J Physiol Renal Physiol. 290 (6), 1516-1524 (2006).
- Lu, B., et al. The control of microvascular permeability and blood pressure by neutral endopeptidase. Nat Med. 3 (8), 904-907 (1997).
- Gendron, G., Simard, B., Gobeil, F., Sirois, P., D’Orleans-Juste, P., Regoli, D. Human urotensin-II enhances plasma extravasation in specific vascular districts in Wistar rats. Can J Physiol Pharmacol. 82 (1), 16-21 (2004).
- Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).
- Saria, A., Lundberg, J. M. Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues. J Neurosci Methods. 8 (1), 41-49 (1983).
- Fricke, I. B., et al. In vivo bioluminescence imaging of neurogenesis – the role of the blood brain barrier in an experimental model of Parkinson’s disease. Eur J Neurosci. 45 (7), 975-986 (2017).
- Pink, D. B., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery. PLoS One. 7 (3), 33760 (2012).
- Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat Rev Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
- Vandoorne, K., Addadi, Y., Neeman, M. Visualizing vascular permeability and lymphatic drainage using labeled serum albumin. Angiogenesis. 13 (2), 75-85 (2010).
- Turner, A. J., Nalivaeva, N. N. Proteinase dysbalance in pathology: the neprilysin (NEP) and angiotensin-converting enzyme (ACE) families. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52 (4), 40-48 (2006).
- Lu, B., Gerard, N. P., Kolakowski, L. F., Finco, O., Carroll, M. C., Gerard, C. Neutral endopeptidase modulates septic shock. Ann N Y Acad Sci. 780, 156-163 (1996).
- Dempsey, E. C., et al. Neprilysin null mice develop exaggerated pulmonary vascular remodeling in response to chronic hypoxia. Am J Pathol. 174 (3), 782-796 (2009).
- Karoor, V., Oka, M., Walchak, S. J., Hersh, L. B., Miller, Y. E., Dempsey, E. C. Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism. Hypertension. 61 (4), 921-930 (2013).
- Chu, P., Arber, D. A. Paraffin-section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma. Am J Clin Pathol. 113 (3), 374-382 (2000).
- Bircan, S., Candir, O., Kapucuoglu, N., Serel, T. A., Ciris, M., Karahan, N. CD10 expression in urothelial bladder carcinomas: a pilot study. Urol Int. 77 (2), 107-113 (2006).
- Koiso, K., Akaza, H., Ohtani, M., Miyanaga, N., Aoyagi, K. A new tumor marker for bladder cancer. Int J Urol. 1 (1), 33-36 (1994).
- Wick, M. J., et al. Protection against vascular leak in neprilysin transgenic mice with complex overexpression pattern. Transgenic Res. 25 (6), 773-784 (2016).
- Natah, S. S., Srinivasan, S., Pittman, Q., Zhao, Z., Dunn, J. F. Effects of acute hypoxia and hyperthermia on the permeability of the blood-brain barrier in adult rats. J Appl Physiol. 107 (4), 1348-1356 (2009).
- Scholzen, T. E., et al. Neutral endopeptidase terminates substance P-induced inflammation in allergic contact dermatitis. J Immunol. 166 (2), 1285-1291 (2001).
