Summary
En este artículo, se describe un protocolo simple, económico y optimizado que utiliza el método de colorante azul de Evans para evaluar extravasación de plasma en los órganos de los ratones FVBN que pueden ser adaptados para su uso en otras cepas, especies y otros órganos o tejidos.
Abstract
Fuga vascular y extravasación de plasma, tiene un número de causas y puede ser una grave consecuencia o síntoma de una respuesta inflamatoria. Este estudio en última instancia puede conducir a nuevos conocimientos sobre las causas de o nuevas maneras de inhibir o tratar la extravasación de plasma. Es importante que los investigadores tienen las herramientas adecuadas, incluyendo los mejores métodos disponibles para el estudio de la extravasación de plasma. En este artículo, se describe un protocolo, utilizando el método de colorante azul de Evans, para evaluar extravasación de plasma en los órganos de los ratones FVBN. Este protocolo es intencionadamente simple, a tan grande un grado de lo posible, pero proporciona datos de alta calidad. Colorante azul de Evans ha sido elegido principalmente porque es fácil para el laboratorio de media utilizar. Hemos utilizado este protocolo para proporcionar evidencia y apoyo a la hipótesis de que la neprilysin de enzima puede proteger la vasculatura contra la extravasación de plasma. Sin embargo, este protocolo puede usar experimentalmente y fácilmente adaptado para el uso en otras cepas de ratones o en otras especies, en muchos diversos órganos o tejidos para estudios que pueden involucrar otros factores que son importantes para entender, prevenir o tratar la extravasación de plasma. Este protocolo ha sido ampliamente optimizado y modificado de los protocolos existentes y combina fiabilidad, facilidad de uso, economía y disponibilidad general de materiales y equipos, hacer superior para el laboratorio de media utilizar en el presente Protocolo cuantificación de la extravasación de plasma de órganos.
Introduction
Fuga vascular en los órganos se refiere a extravasación o salida de plasma sanguíneo a través de brechas en el endotelio de post vénulas capilares en los órganos. Esta extravasación de plasma o el aumento de la permeabilidad vascular, que puede surgir de algún tipo de respuesta inflamatoria, puede tener graves consecuencias. Por lo tanto, es importante que este fenómeno, sus causas, moduladores y consecuencias, están estudiadas y entendidas, y además, que los investigadores tienen buenas herramientas y protocolos con los que estudiar. Las brechas endoteliales pueden ser producidas a través de una serie de estímulos, pero generalmente se producen por la acción de neurotransmisores péptido o taquicininas en el endothelia. Uno de los principales mediadores naturales de este proceso, que resulta en extravasación de plasma mayor, es el undecapeptide taquiquinina neuropéptido sustancia P1.
Métodos para investigar y medir la permeabilidad vascular o extravasación de plasma, que utilizan la propiedad de unión a albúmina del colorante azul de Evans, se han desarrollado y generalmente son conocidos por su precisión, sencillez, economía, seguridad y capacidad de permitir que el determinación de la extravasación de plasma de varios tejidos a la vez, si es así deseado2,3,4,5,6,7,8,9 . Este protocolo de azul de Evans para evaluar extravasación de plasma en los órganos de los ratones FVBN utiliza todos estos, pero añade algunas modificaciones importantes que lo hacen generalmente útil y adaptable para estudios futuros, el laboratorio promedio lleva a cabo o que llevar a cabo importantes estudios de factores asociados a la extravasación de plasma o en la permeabilidad vascular. En este protocolo, sustancia P es introducida a los ratones a 1 nmol/kg, lo que aumenta la extravasación de plasma por 1.5. Esto aumenta la sensibilidad del Protocolo, dando por resultado más fácilmente observables y obtener resultados. Otros factores que afectan a la permeabilidad, como varios otros péptidos, productos químicos o algunas formas de lesión tóxica, pueden ser utilizados o estudiados por otros laboratorios, como se desee. En este protocolo para introducir el azul de Evans y sustancia P sistémica, que requiere cirugía terminal se utilizan inyecciones de vena yugular. Sin embargo, las inyecciones de vena yugular5,7,10, incluso después de la consideración de las necesarias técnicas quirúrgicas terminal, son fáciles de dominar y conducir a la producción de resultados más consistentes que otra las inyecciones venosas, incluyendo cola vena inyecciones4,9. Aunque es posible de azul de Evans ser entregados por las inyecciones del seno venoso orbital retro, no hay referencias en la literatura han encontrado que utilizar este método de entrega de azul de Evans. Sin embargo, en cuanto a las inyecciones de vena de la cola, el alto grado de conocimientos y práctica reproducible dominar esta técnica muy limita su uso para inyección de azul de Evans exitosa. En contraste, el método de inyección de la vena yugular alternativos como se describe en nuestro protocolo, ofrece una solución técnicamente obtenible. Un procedimiento crucial para la perfusión de las venas del ratón, realizado justo después del sacrificio del ratón de perfusión de azul de Evans, elimina el exceso de tinte de azul de Evans y se ha estandarizado en el presente Protocolo. Métodos anteriormente descritos de perfusión han sido cuidadosamente examinados y modificado para conocer el presente procedimiento. Otras modificaciones que se describen aquí son todo optimizado, simple y de bajo costo.
Existen algunas limitaciones importantes del método de colorante azul de Evans. Por ejemplo, baja sensibilidad a veces asociado con este método puede prevenir algunos adicional examen macroscópico patológico e histológico de los tejidos de los animales de inyección de azul de Evans. Sin embargo, estas y otras limitaciones han llevado al desarrollo de métodos alternativos y modelos que, sin embargo, todavía utilizan el azul de Evans. La medición de azul de Evans por fluorescencia (en lugar de alcance visual) espectroscopia puede aumentar la sensibilidad del método. Además, microscopía de fluorescencia de los tejidos teñidos de azul de Evans fue desarrollado para permitir la observación de fuga vascular en más distintas ubicaciones11. Además, todo el cuerpo la proyección de imagen y escaneo de un animal vivo previamente inyectaron con Evans azul12 permite la investigación de las concentraciones de azul de Evans en una manera continua, en lugar de en uno elegido tiempo punto específico del experimento. Sin embargo, este método requiere la disponibilidad de instalaciones adecuadas de imagen y puede ser muy costoso. Modificaciones que Evans blue y realizada en un tipo de in vitro del modelo, como en una celda de cultura o chick corioalantoideas modelo13 (CAM) también se han descrito. Estos modelos son monitoreados por fluorescencia y microscopia intravital14 y permiten la cuantificación de cambios en la permeabilidad vascular con el tiempo, pero pueden plantear preguntas sobre modelado preciso de condiciones en vivo y también puede caro.
Ha habido otros métodos desarrollados para determinar y cuantificar fuga vascular o permeabilidad, que implica la administración de azul de Evans. Estos métodos pueden emplear una adecuada molécula fluorescente (como la albúmina o fluoresceína) o una molécula etiquetada isotópicamente etiquetada o no, a los animales vivos (o para la célula cultura o corioalantoideas (CAM) modelos13, seguido de no invasivo proyección de imagen (PET-TAC, resonancia magnética, microscopía intravital, escaneo de cuerpo entero) o por proyección de imagen invasivas (microscopia fluorescente)3,12,15. Aunque estas técnicas pueden ofrecer a una serie de ventajas sobre otros Evans métodos azul, también tienen desventajas, que pueden incluir su considerable complejidad, conocimientos necesarios, recursos y altos costos monetarios.
Neprilysin16 (la peptidasa enzima NEP, también conocido como CD10, MME o Enkephalinase) se ha sugerido para ser implicados en la inhibición de extravasación de plasma, al menos en parte, a través del metabolismo enzimático y la inactivación de sustancias endógenas Así, en los tejidos en que ocurre la peptidasa superficie celular NEP, puede haber una atenuación del efecto de la sustancia P, probablemente por la actividad de la peptidasa de NEP.
Al principio, probamos para la extravasación de plasma inducido por la sustancia P utilizando este protocolo modificado de Evans blue, con FVBN tipo salvaje (WT) y ratones knockout (KO) de NEP. Participación de la NEP en extravasación de plasma aumentada de sustancia P fue sospechada de estos estudios iniciales, y describimos a estos y otros experimentos papel de NEP participación en extravasación de plasma. Sin embargo, el foco de este manuscrito no es NEP o su papel en la extravasación de plasma, pero más bien la extravasación de plasma experimentos ellos mismos. Los resultados de la NEP son representante de la clase de resultados que pueden obtenerse mediante el uso de este protocolo modificado. El método de azul de Evans para medir la extravasación de plasma ha sido optimizado y modificado, como se describe en detalle a continuación para los ratones FVBN.
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Protocol
Se siguieron todas las directrices internacionales, nacionales o institucionales aplicables para el uso y cuidado de animales (ratones) en los experimentos descritos en este manuscrito.
Este método utiliza ratones adultos FVBN, edad 16-20 semanas, encontrado para ser óptimo para los fines de este estudio. Día 1 incluye pasos 1-5 y el día 2 incluye los pasos 6-7 (figura 1).
1. preparación de equipo
- Garantizar un suministro adecuado de jeringas estériles, desechables y agujas, si ketamina/xilacina se utiliza como anestésico (como se recomienda). Si isoflurano se utiliza como anestésico, verifique el tanque de oxígeno y el nivel de líquido de isoflurano para asegurarse de que hay un suministro adecuado para el experimento antes de comenzar. Además, montar la nariz respiración circuitos y fije a la caja de la inducción; Coloque latas de carbón nuevo a los circuitos de respiración. Preparar el cuadro de inducción activando el oxígeno y comprobar que la segunda etapa Lee aproximadamente 50 psi.
- Encienda el cojín de calentamiento a 37 ° C.
- Preparar la sonda de temperatura rectal para la cirugía.
2. ratón preparación
Este paso incluye anestesia, depilación y posicionamiento (adultos FVBN ratones-edad 16-20 semanas).
- Pesan los ratones y registrar los pesos.
- Anestesiar los ratones.
- Administrar ketamina y xilacina IP (80-100 mg/kg y 7.5-16 mg/kg, respectivamente). Sin embargo, se recomienda comenzar con dosis bajas de ketamina y xilacina (alrededor de 30 mg/kg y 6 mg/kg, respectivamente).
- Mantener la anestesia con aproximadamente 0,1 - 0,25 veces inicial de dosis de ketamina/xilacina a lo largo de la cirugía. Ketamina y xilacina eran el agente anestésico de elección en este estudio en particular, como se observaron más reproducibilidad y capacidad de supervivencia. El agente anestésico de elección en otros estudios se puede encontrar a ser diferente. Si se utiliza isoflurano, ponga el ratón en una cámara de inducción y encienda isoflurano al 5% hasta que el ratón pierde el sentido completo. Luego use una nariz nasal de isoflurane 1.5-2.5% en el resto del procedimiento.
- Controlar los ratones cada 2-3 min por pellizco del dedo del pie para verificar la adecuada profundidad de la anestesia.
- Afeite la zona ventral del cuello del ratón.
- Coloque el ratón en una posición supina en la almohadilla de precalentado. Asegure las patas y los pies del ratón a la superficie quirúrgica con cinta.
- Coloque el ungüento de lágrima artificial en los ojos para evitar que se sequen durante la cirugía.
3. quirúrgicos detalles
- Realice una incisión de 1 cm en el cuello ventral derecho sobre la vena yugular.
- Aplicar una o dos gotas de lidocaína (1-2%) en el área de incisión para el tratamiento del dolor y promover la vasodilatación. Esperar 2 minutos para lidocaína surta efecto.
- Denunciar y aislar la vena yugular interna derecha por disección Roma. Atar la vena con la sutura 4-0 y retraer con suavidad el extremo rostral de la nave con una pinza hemostática. Orificio, con unas tijeras finas, unos 3 mm inferior o caudal a la corbata, aproximadamente a la mitad el diámetro de la vena.
- Un catéter de polivinilo PV-1 1,5 cm desde el extremo de la marca introduzca en la vena yugular a través del orificio usando un dilatador de vasos y el catéter hacia el extremo caudal de la nave, aproximadamente 1,5 cm del hilo de rosca.
- Atar el catéter firmemente dentro de la parte caudal de la embarcación (por debajo de la cut), con seda 4-0. Ate la parte rostral de la embarcación hacia el exterior de la sonda con los extremos sueltos de la sutura que se utiliza para atar la vena yugular rostral, en el paso 3.3.
- Virada la piel libremente de nuevo juntos alrededor del catéter con seda 4-0 para ayudar a prevenir pérdida de calor corporal y la desecación de los tejidos.
- Conectar el catéter a una jeringa con solución salina heparinizada (10 U/mL) y enjuague el catéter.
4. inyecciones
- Inyecte la solución de azul de Evans (50 μL de una solución de 30 mg/mL en solución salina normal, unheparinized 0.9%, o aproximadamente 50 mg/kg) en el catéter de la vena yugular, seguido de un pequeño volumen de solución salina heparinizada para purgar la línea.
- 2 minutos más tarde, inyectar sustancia P (100 μL de una solución 0,3 μM en 0,9% solución salina normal, unheparinized o 1 nmol/kg), seguida de un pequeño volumen de solución salina heparinizada para purgar la línea. Sustancia P aumenta la extravasación de proteínas plasmáticas a través de la capa endotelial; en este protocolo, habitualmente induce un aumento de los valores de extravasación de plasma de aproximadamente 1.5-fold, cual plasma extravasación más fácil de medir.
- Esperar 18 minutos después de inyectar la sustancia P. Durante este tiempo, el tinte de azul de Evans se equilibre y circular.
- Terminar el experimento 18 minutos después de la inyección de sustancia P (20 min después de la inyección de azul de Evans) sacrificando el ratón con la dislocación cervical. Es probable que el ratón puede ser directamente cervical dislocada, sin primero dar una sobredosis de anestésico, como el ratón es probablemente todavía bien anestesiado de la cirugía. Sin embargo, si es necesario, una sobredosis de anestésicos ketamina/xilacina, isoflurano o pentobarbital puede ser dado, seguido por dislocación cervical.
5. aislamiento de órganos
- Abrir la cavidad torácica del ratón y gravedad-perfusión (desde una altura de unos 51 cm o 20") el corazón y los vasos sanguíneos con 50 mL de citrato de sodio 50 mM, pH 3.5. pH 3,5 probablemente conserva a encuadernación azul de Evans a la albúmina.
- Suprimir los órganos relevantes 1-5 (tejidos) con un bisturí de disección (e.g. vejiga urinaria, riñón, estómago, hígado, páncreas, proximal o distal colon, íleon, duodeno, piel del flanco, orejas, cola, corazón y/o los pulmones) y quitar cualquier contenido residual, si presente.
- Enjuague los órganos en temperatura ambiente (RT) con tampón fosfato salino (PBS; 1,44 g de Na2HPO4, 0,24 g de KH2PO4, 8.0 g de NaCl y 0,20 g de KCl en 1 L, pH 7,4).
- Seque los órganos con tejido, corte cada órgano por la mitad y pesan cada mitad (mojado pesos, en g).
- Seque uno mitad del tejido en un horno de secado a 150 ° C, en florete, durante 48 h.
- Coloque los otros tejidos del tubo la mitad en un volumen constante (200 μL) de formamida en una microcentrífuga durante 48 h (y hasta 72 h) para extraer el azul de Evans.
6. medición del tejido OD
- Saque 50 μl de formamida infundido de azul de Evans (después de la incubación de 48-72 h RT) el tubo de microcentrífuga y el lugar en un pozo de una placa de poliestireno de 96 pocillos. Tenga cuidado de no transferir piezas de tejido junto con la formamida.
- Depositar 50 μl de formamida nueva, pura en cada uno de los dos pozos vacíos de la placa de 96 pocillos para los espacios en blanco.
- Mida y registre la OD620 de cada pocillo de la placa de 96 pocillos en un lector de absorbancia. 620 nm es la absorbancia máxima de azul de Evans.
7. cálculo de la extravasación de Plasma
- Pesa el tejido seco mitad que ha estado en el horno durante 48 h.
- Calcular la proporción de peso seco/peso húmedo para el órgano específico de interés de cada ratón individual, comenzando con el peso húmedo de este tejido medio (obtenido en paso 5.4), dividido por el peso seco de este mismo tejido medio (obtenido en paso 7.1).
- Calcular el peso seco (en gramos) de tejido medio en formamida al dividir el peso mojado del tejido antes de que la mitad se colocó en formamida (obtenido en el paso 5.4) por la humedad: proporción de peso seco para el órgano específico de interés (calculado en el paso 7.2).
- Calcular los valores corregidos de620 OD. A partir de la OD620 valor de cada bien experimental de la placa de 96 pocillos (contiene formamida infundido de azul de Evans de cada tejido, obtenido en el paso 6.3), reste el espacio en blanco bien OD620 valor (la media OD620 de los dos pozos que contienen formamida puro, preparado en el paso 6.2, OD a620 los valores obtenidos en el paso 6.3) de cada valor experimental.
- Calcular el valor de extravasación de plasma por la corregida OD620 (calculado en paso 7.4) dividiendo el peso seco del tejido mitad en formamida (calculado en paso 7.3). Las unidades de la extravasación de plasma será OD620/g peso seco.
- Analizar los datos y expresar como la media ± SEM. estadísticamente comparar grupos por prueba t o análisis unidireccional de varianza y prueba de comparación múltiple de Scheffé (lycofs01.lycoming.edu), según corresponda.
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Representative Results
En la figura 1, se muestra un esquema del procedimiento, que se ha encontrado en los valores más confiable y consistente de extravasación de plasma inducido por la sustancia P de órganos de los ratones FVBN. Este procedimiento toma generalmente dos días de trabajo, separados por al menos 48 h de tiempo de espera. Es posible extender aún más, si esto se hace sistemáticamente para que todos los experimentos comparar. Por ejemplo, después de que los órganos están aislados el día 1, los órganos pueden ser flashes congelado en nitrógeno líquido y se almacenaron a-80 ° C; en descongelación cuidadosamente los órganos (dentro de un par de días a 1 semana), pueden ser lavadas en PBS y borrados antes que el resto del protocolo. También, aunque la sequedad de los tejidos debe realizarse como se indica (a 150 ° C por 48 h), la extracción de Evans blue del tejido medio en formamida puede ampliarse de 48-72 h, como el tiempo en formamida es consistente para todos los experimentos.
Se muestra en la figura 2 y tabla 1 datos demuestra extravasación de plasma inducido por la sustancia P de las vejigas urinarias de FVBN tipo salvaje (WT) y de ratones knockout (KO) de NEP17, que eran sobre todo debido a este laboratorio intereses desde hace mucho tiempo en la NEP y la regulación y acciones de neuropéptidos seleccionado18,19. Ratones KO de la NEP no expresan NEP en cualquier tejido. Sin embargo, la NEP se expresa dentro de la vejiga de los ratones WT, aunque a niveles bajos20,21,22. Figura 2 y tabla 1 sugieren que existe una diferencia en la extravasación de plasma inducido por la sustancia P de las vejigas urinarias de estos dos grupos de ratones. Esto implica un papel para el NEP en extravasación de plasma inducido por la sustancia P de la vejiga urinaria, ya que la expresión de la NEP es potencialmente la principal diferencia en las vejigas urinarias de los ratones WT y NEP KO.
Porque los datos originales sugieren un posible papel para el NEP en extravasación de plasma inducido por la sustancia P en la vejiga urinaria (figura 2 y tabla 1), decidimos investigar más plenamente la implicación de la NEP en extravasación de plasma en otro órgano. En primer lugar, hemos creado un ratón doble transgénico que sobrexpresan NEP casi universal23. Este ratón diseñado permite una comparación de los datos de tres tipos de ratones FVBN: WT ratones16, que naturalmente expresan una cantidad limitada de la NEP en muchos tejidos; NEP KO ratones17, que no expresan NEP en cualquier tejido; y nuestro doblemente transgénicos NEP overexpressor ratones23, que sobrexpresan NEP en casi todos los tejidos tras la administración de doxiciclina. Ratones se permitieron el acceso libre a que contiene doxiciclina chow durante 1 semana antes de la cirugía (figura 1); dosis de doxiciclina es de 1 mg/kg de chow, sin teñir. La construcción de estos ratones doblemente transgénicos que sobreexpresan NEP detallada, descripción de ensayos de la NEP, westerns y NEP mRNA qPCR23.
Con estos 3 tipos de ratones, este protocolo muestra un papel para el NEP en extravasación de plasma en los tejidos, incluyendo el duodeno23 (figura 3 y tabla 2). En estos experimentos, la sobreexpresión de la NEP en los ratones de overexpressor NEP doblemente transgénicos fue activada por la alimentación, para 1 semana antes del día 1, chow que contiene doxiciclina (undyed; chow de doxiciclina/mg 1 mg, figura 3a). Como control, algunos ratones WT y NEP KO también fueron alimentados con el chow de doxiciclina sin teñir durante la semana anterior el día 1 (figura 3b y 3 c).
Para confirmar el papel de la NEP en la extravasación de plasma que en el duodeno de los ratones FVBN, la expresión de la NEP en el duodeno de FVBN WT y NEP (doblemente transgénico) ratones de overexpressor alimentados con chow doxiciclina fue confirmada por análisis occidental con un anticuerpo policlonal contra NEP humana (que cross-reacts con ratón NEP)23. Este análisis confirmó que duodenums WT expresan cantidades moderadas de proteína de la NEP, pero las duodenums de overexpressor de NEP expresan x 2-3 las cantidades de la NEP expresadas por el duodenums de peso. Los ratones KO de la NEP, por definición, no expresan ningún NEP en el duodeno.
Figura 1: esquema General del protocolo para la medición de extravasación de plasma inducido por la sustancia P. Esquema del protocolo para la medición de extravasación de plasma inducido por la sustancia P de los órganos de los ratones FVBN (edad 16-20 semanas). Este protocolo consiste en la medición de la extravasación de plasma tejido por el método del colorante azul de Evans a través de inyección en la vena yugular e incorpora exógeno administrada sustancia P, para obtener la extravasación de plasma aumentada y fácilmente medibles valores, en unidades de OD620/g peso seco. El protocolo descrito se ha encontrado para dar lugar a valores de extravasación plasma inducido por la sustancia P constante de diversos órganos de ratones FVBN y toma un mínimo de dos días de trabajo. Día 1 y día 2 están separados por al menos 48 h de tiempo de espera para que los tejidos en seco y extraer. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Extravasación de plasma inducido por la sustancia P de la vejiga urinaria de ratones WT y NEP KO. Vejiga urinaria extravasación de plasma de los ratones FVBN (sin previa doxiciclina) aumentada por la administración de la sustancia P y se expresa como OD620 nm/g de peso seco. Vejigas urinarias fueron aislados de FVBN tipo de salvaje (WT, barra blanca, n = 12) o el agujero ciego de la NEP FVBN (KO; barra negra, n = 7) ratones y sometidas a lo protocolo de extravasación de plasma como se detalla arriba. Los valores individuales se dan en la tabla 1. Las líneas encima de las barras representan el error estándar de la media (SEM). Los valores de WT y NEP KO marcado una tendencia hacia una diferencia significativa p = 0,051 por prueba t. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 : Extravasación de plasma inducido por la sustancia P desde el duodeno de los ratones overexpressor WT, NEP KO y NEP. (A-C) Extravasación de plasma duodenal aumentada por la administración de la sustancia P y expresada como peso seco de OD620/g. Duodenums (A) fueron aisladas de los ratones WT FVBN sin previa doxiciclina (-; blanco de la barra, n = 5), ratones KO de NEP sin previa doxiciclina (-; luz barra gris, n = 5), ratones doblemente transgénicos de NEP ovexpressor sin previa doxiciclina (DT-; barra gris oscura, n = 5) o NEP ratones transgénicos doblemente ovexpressor con doxiciclina previo (DT +; negro de la barra, n = 4) y el protocolo de extravasación de plasma como se detalla arriba. Las líneas encima de las barras representan el SEM. Aunque los valores NEP KO (-) marcado una tendencia más importante que el peso (-) o DT (-) valores, esta diferencia no fue estadísticamente significativa. Valores de extravasación de plasma duodenal fueron disminuidos significativamente sólo con el grupo de doxiciclina alimentado, ratones transgénicos doblemente de NEP ovexpressor (DT +), en comparación con todos los demás (* p < 0.05, análisis de varianza). (B, C) Valores de extravasación de plasma duodenal de los ratones WT y NEP KO no fueron afectados significativamente por la administración de doxiciclina (p < 0,05). (B) peso de ratones sin doxiciclina (WT-; barra blanca, n = 5) y los ratones WT con doxiciclina (WT +; media barra gris, n = 7). (C) NEP KO ratones sin doxiciclina (KO-; barra gris luz, n = 5) y NEP KO con doxiciclina (KO +; media barra gris, n = 2). Valores individuales se muestra como un compuesto en A, B y C, se dan en la tabla 2. Reproducido con modificaciones menores del Springer journal artículo23 con el permiso de ciencia de Springer + Business Media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Genotipo | sexo | relación de peso húmedo/seco de vejiga urinaria | húmedo medio peso de vejiga urinaria (g; en 85 de μL de formamida) | calcula el peso seco de vejiga urinaria medio (g) | OD 620 nm - en blanco | OD 620 nm/g de peso seco (vejiga urinaria) |
| WT | F | 4.737 | 0.0038 | 0.0008 | 0.0150 | 18.750 |
| WT | M | 4.632 | 0.0045 | 0,0010 | 0.0100 | 10.000 |
| WT | F | 4.700 | 0.0048 | 0,0010 | 0.0280 | 28.000 |
| WT | F | 4,625 | 0.0068 | 0.0015 | 0.0230 | 15.333 |
| WT | F | 4.546 | 0.0077 | 0,0017 | 0.0400 | 23.529 |
| WT | M | 4.800 | 0.0094 | 0.0020 | 0.0570 | 28.500 |
| WT | M | 5.500 | 0.0095 | 0,0017 | 0.0240 | 14.118 |
| WT | F | 4.316 | 0.0098 | 0.0023 | 0.0660 | 28.696 |
| WT | M | 5.061 | 0.0121 | 0.0024 | 0.0400 | 16.667 |
| WT | M | 5.061 | 0.0192 | 0.0038 | 0.0330 | 8.684 |
| Media +/-SEM (de entradas en la columna anterior) | 4.798 +/-0.105 | 0.0088 +-0,0014 | 0.0018 +-0.0003 | 0.0336 +-0.0056 | 19.228 +-2.393 | |
| KO | M | 4.316 | 0.0196 | 0.0045 | 0.1610 | 35.778 |
| KO | M | 4.600 | 0.0134 | 0.0029 | 0.1020 | 35.172 |
| KO | M | 4.377 | 0,0104 | 0.0024 | 0.0410 | 17.083 |
| KO | M | 4.727 | 0,0258 | 0.0055 | 0.1410 | 25.636 |
| KO | F | 4.539 | 0.0025 | 0.0006 | 0.0250 | 41.667 |
| KO | M | 4.457 | 0.0149 | 0.0033 | 0.1420 | 43.030 |
| Media +/-SEM (de entradas en la columna anterior) | 4.503 +-0,062 | 0.0144 +/-0.0032 | 0.0032 +-0.0007 | 0.1020 +-0.0233 | 33.061 +-4.065 |
Tabla 1: extravasación de plasma inducido por la sustancia P de la vejiga urinaria de los ratones WT y NEP KO. Valores de extravasación de plasma de los ratones FVBN (sin previa doxiciclina) se expresaron individualmente como OD620 nm/g de peso en seco de FVBN peso (n = 12) o NEP KO (n = 7) ratones y sometidas a lo protocolo de extravasación de plasma como se detalla arriba. No hay diferencias de género eran evidentes en los valores de la extravasación de plasma. Vejigas urinarias fueron aislados; individuales se dan los valores para la relación de peso húmedo/seco calculado de vejiga urinaria, el peso húmedo de la vejiga urinaria en formamida, el calculado peso seco de la vejiga urinaria en formamida (en g), la corrección OD620 nm (muestra OD620 nm menos el nmof de meanOD620 los espacios en blanco (puro formamida) y el valor de la extravasación de plasma calculado en OD620 nm/g peso seco de (el nanómetro OD620 corregida, dividido por el peso seco calculado). Los valores de la extravasación de plasma resultante fueron utilizados para construir la figura 2.
| Chow de genotipo y doxiciclina, sin (-) o con (+) | sexo | relación de peso húmedo/seco del duodeno | húmedo medio peso del duodeno (g; en 85 de μL de formamida) | calcula el peso seco del duodeno medio (g) | OD 620 nm - en blanco | OD620 nm/g de peso seco (duodeno) |
| WT- | M | 4.927 | 0.0307 | 0.0062 | 0.0640 | 10.272 |
| WT- | F | 4.912 | 0.0172 | 0.0035 | 0.0460 | 13.138 |
| WT- | M | 5.333 | 0.0281 | 0.0053 | 0.0960 | 18.221 |
| WT- | F | 5.433 | 0.0375 | 0.0069 | 0.1010 | 14.634 |
| WT- | M | 5.179 | 0.0287 | 0.0055 | 0.0430 | 7.759 |
| Media +/-SEM (de entradas en la columna anterior) | 5.157 +/-0.105 | 0.0284 +-0.0033 | 0.0055 +-0.0006 | 0.0700 +-0.0122 | 12.805 +-1.798 | |
| WT + | M | 5.342 | 0.0542 | 0.0101 | 0.1520 | 14.981 |
| WT + | M | 5.653 | 0.0477 | 0.0084 | 0.1120 | 13.272 |
| WT + | M | 5.700 | 0.0564 | 0.0099 | 0.1110 | 11.218 |
| WT + | F | 5.542 | 0.0498 | 0,0090 | 0.1430 | 15.914 |
| WT + | F | 5.723 | 0.0266 | 0.0046 | 0.0470 | 10.112 |
| WT + | F | 5.186 | 0.0262 | 0.0051 | 0.0470 | 9.304 |
| WT + | M | 5.543 | 0.0342 | 0.0062 | 0.0480 | 7.779 |
| Media +/-SEM (de entradas en la columna anterior) | 5.527 +/-0.075 | 0.0422 +-0.0049 | 0.0076 +-0.0009 | 0.0943 +-0.0175 | 11.797 +-1.142 | |
| KO- | F | 5.763 | 0.0209 | 0.0036 | 0.0690 | 19.025 |
| KO- | M | 4.232 | 0.0164 | 0.0039 | 0.1010 | 26.061 |
| KO- | M | 4.810 | 0.0227 | 0.0047 | 0.0880 | 18.647 |
| KO- | F | 5.650 | 0.0363 | 0.0064 | 0.0600 | 9.339 |
| KO- | M | 5.212 | 0.0178 | 0.0034 | 0.0640 | 18.739 |
| Media +/-SEM (de entradas en la columna anterior) | 5.133 +-0.282 | 0.0228 +/-0.0035 | 0.0044 +/-0.0005 | 0.0764 +-0.0078 | 18.362 +-2.659 | |
| KO + | M | 5.128 | 0.0193 | 0.0038 | 0.0600 | 15.941 |
| KO + | M | 5.030 | 0.0459 | 0.0091 | 0.1980 | 21.697 |
| Significa +-rango (de entradas en la columna anterior) | 5.079 +-0.049 | 0.0326 +-0.0133 | 0.0065 +-0.0027 | 0.1290 +/-0.0690 | 18.819 +-2.878 | |
| DT- | M | 5.426 | 0.0322 | 0.0059 | 0.0775 | 13.058 |
| DT- | M | 4.255 | 0.0360 | 0.0085 | 0.0895 | 10.579 |
| DT- | M | 4.818 | 0.0306 | 0.0064 | 0.1460 | 22.989 |
| DT- | M | 5.189 | 0.0197 | 0.0038 | 0.0380 | 10.010 |
| DT- | F | 5.500 | 0.0256 | 0.0047 | 0.0390 | 8.379 |
| Media +/-SEM (de entradas en la columna anterior) | 5.038 +-0.229 | 0.0288 +-0.0028 | 0.0059 +-0.0008 | 0.0780 +-0.0198 | 13.003 +/-2.3607 | |
| DT + | M | 5.008 | 0.0694 | 0.0139 | 0.0270 | 1.948 |
| DT + | M | 4.750 | 0.0660 | 0.0139 | 0.0070 | 0.504 |
| DT + | M | 5.495 | 0.0587 | 0.0107 | 0.0692 | 6.478 |
| DT + | M | 5.233 | 0.0542 | 0,0104 | 0.0620 | 5.986 |
| Media +/-SEM (de entradas en la columna anterior) | 5.121 +-0.159 | 0.0621 +-0.0034 | 0.0122 +-0,0010 | 0.0413 +-0.0147 | 3.729 +-1.478 |
Tabla 2: extravasación de plasma inducido por la sustancia P de los duodenums de los ratones de overexpressor WT, NEP KO y NEP. Valores de extravasación de plasma de los ratones FVBN (con o sin previa doxiciclina) se expresaron individualmente como OD620 nm/g de peso en seco de los ratones WT FVBN (n = 5 y n = 7 con doxiciclina), ratones KO de NEP (n = 5 y n = 2 con doxiciclina) y el NEP ratones transgénicos doblemente overexpressor (n = 5 y n = 4 con doxiciclina). Ratones fueron sometidos al Protocolo de extravasación de plasma como se detalla arriba. No hay diferencias de género eran evidentes en los valores de la extravasación de plasma. Duodenums fueron aislados; los valores utilizados en el cálculo de extravasación de plasma eran como descrito en la tabla 1. Los valores de la extravasación de plasma resultante fueron utilizados para construir figura 3A-c.
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Discussion
Como hemos comentado anteriormente, el estudio de la extravasación de plasma en última instancia puede llevar a nuevos conocimientos sobre las causas de o nuevas maneras de inhibir o tratar la extravasación de plasma. El uso acertado del Protocolo de extravasación de plasma (arriba), utilizando medio de contraste azul de Evans, se ha demostrado en el manuscrito actual. Aunque los datos se muestra de nuevo la hipótesis de que la NEP puede proteger la vasculatura contra la extravasación de plasma, este es un objetivo secundario en la actualidad, con el objetivo principal es presentar un protocolo optimizado que puede usarse fácilmente en el laboratorio promedio para el estudio de la extravasación de plasma. El protocolo reportado en el presente documento se centra en la adaptabilidad a futuros estudios con objetivos diferentes, animales, órganos y otras condiciones, es especialmente útil debido a que este protocolo es fácil de usar, confiable, económico y tiene en cuenta el general disponibilidad de materiales comunes, reactivos y personal capacitado. Cabe señalar, sin embargo, que este protocolo requiere una gran cantidad de repeticiones por grupo de animales (8-12 repeticiones sugeridos) para obtener resultados estadísticamente válidos.
Ha habido numerosos estudios e informes que detallan los intentos para medir la permeabilidad vascular y extravasación de plasma. Por el momento, la mayoría de estos informes detalla permutaciones de los métodos utilizados junto con el método del colorante azul de Evans para investigar la extravasación de plasma y de la permeabilidad vascular2,3,6,11, 12,13. Ha habido pocos informes de métodos de permeabilidad vascular que no incorporan a Evans blue en todos3,13,15,24; Estos métodos son en general menos accesible para el promedio de laboratorio, que requiere métodos complicados, equipo especializado y personal y son generalmente caros.
El desarrollo del Protocolo de azul de Evans por encima implicó la prueba de muchos diferentes permutaciones y modificaciones. Experimentos tempranos se centraron en los intentos de inyectar a través de la vena de la cola de ratón azul de Evans. Sin embargo, la cola vena inyecciones resultadas técnicamente desafiante y dio lugar a resultados inconsistentes, lo que requeriría la inclusión de las inyecciones de la vena yugular y terminal técnicas quirúrgicas descritas. Muchos experimentos preliminares fueron también hecho tratando de encontrar las concentraciones adecuadas de Evans blue y sustancia p. La cantidad exacta de azul de Evans no fue encontrada para ser imprescindible, como es por debajo de 200 mg/kg (en comparación con 50 mg/kg utilizado en la actualidad), pero la cantidad de sustancia P utilizada en estos experimentos era importante. Después de mucha experimentación, 1 nmole/kg se encontró que la concentración ideal de exógeno agregada sustancia P, dando como resulta un aumento de 1.5-fold de (y así más fácilmente medible) valores de extravasación de plasma. También, se encontró que un tiempo adecuado debe ser para que el azul de Evans se equilibren (> 10 min). Perfusión de los vasos sanguíneos para eliminar a exceso Evans blue, después del sacrificio del ratón, pero antes de aislamiento de órgano, fue encontrada para ser un componente esencial del presente Protocolo, a diferencia de otros protocolos que no incluyen este paso de perfusión4. La solución (entregada por un gradiente suave gravedad) es de 50 mL de una solución de pH 3,5 (que fomenta la Unión del azul de Evans y albúmina); paraformaldehido, frecuente en muchos otros Evans protocolos azul6,10,25, se omite en el presente Protocolo. Otro factor que ha sido resuelta en este protocolo es que el tinte usado en chow de doxiciclina interfiere con la medición de nm OD620 de azul de Evans en los tejidos de la vía alimentaria. Así, fue necesario utilizar chow doxiciclina sin teñir en los experimentos anteriores. También, un hallazgo importante y útil es que casi cualquier órgano del ratón satisfactoriamente es aislado y examinado mediante el presente Protocolo.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Andy Poczobutt y Dr. Jori Leszczynski por su valiosa ayuda y ediciones a este manuscrito. Apoyado por subvenciones recibidas desde el corazón nacional, pulmón y Blood Institute (NHLBI to1 HL078929, PPG HL014985 y HL095439 RO3) y el Departamento de Veterans Affairs (de mérito).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| isoflurane | Vet One | 200-070 | inhaled anesthetic |
| ketamine | Vet One | 200-055 | injectable anesthetic |
| xylazine | Lloyd Laboratories | 139-236 | injectable anesthetic |
| syringes (10,3 & 1 cc) | Becton Dickinson | 309604, 309657, 309659 | |
| needles (20G1,23G1 & 26G1/2) | Becton Dickinson | 305178, 305193, 305111 | |
| isoflurane induction chamber | VetEquip | 941443 | 1 Liter |
| nosecone breathing circuits | VetEquip | RC2 | Rodent Circuit Controller 2 |
| oxygen tank | Airgas | UN 1072 | 100% medical |
| heating pad | CWE Inc. | TC-1000 | temperature controller |
| rectal temperature probe | CWE Inc. | 10-09012 | mouse |
| balance (for rodents) | Ohaus | CS 2000 | |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 15000-00 | Vannas Spring scissors 3mm straight blade (cutting vessels) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11151-10 | Graefe extra fine forceps (isolating mouse vessels) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13009-12 | Halstead-mosquito hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools -suture drivers | Fine Science tools | 12502-12 | Olsen-Hegar suture drivers (suturing) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11627-12 | Adson-Brown alligator forceps (tissue grasping suturing, rat) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14110-15 | Mayo tough cut scissors 15 cm (surgery, dissection, bones, rat) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 18025-10 | suture tying forceps (used for Millar cath) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14078-10 | Lexer Baby scissors straight (surgery, mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Dumont #5 fine-tip forceps (rat vessels, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14082-09 | Dissector scissors 12 mm (surgery, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11051-10 | 10 cm Graefe forceps (tissue grasping, rat mouse) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11251-35 | Dumont 5/45 forceps (introducer for vessels) |
| surgical tools-retractors | Fine Science tools | 17012-11 | Weitlaner retractors 2/3 tooth (rat surgical) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11294-00 | Dumont #4 forceps (vessel isolation rats, mice) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11297-00 | Dumont #7 forceps (tissue grasping, dissection) |
| surgical tools-scissors | Fine Science tools | 14058-11 | tough cut iris scissors (mouse dissection, bones) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11009-13 | serrated, curved Semken forceps (tissue grasping, mouse rat) |
| surgical tools-hemostats | Fine Science tools | 13003-10 | Hartman curved hemostats (blunt dissect, hold tissue) |
| surgical tools-forceps | Fine Science tools | 11006-12 | Adson serrated forceps (tissue grasping) |
| clippers | Oster | A5 | |
| tape | Fisherbrand | 159015G | |
| artificial tear ointment | Akorn Inc | 13985-600-03 | |
| lidocaine | Hospira | 0409-4277-01 | 2% injectable |
| polyvinyl catheters | Tygon | PV-1 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Substance P | Bachem | H-1890 | |
| heparin | Sagent Pharmaceuticals | 25201-400-10 | 1000 U/ml |
| saline solution | Hospira | 0409-7138-09 | 0.9% sodium chloride |
| phenobarbital | Vortech | 0298-9373-68 | |
| sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417-50TAB | |
| Kimwipes for blotting | Fisher Scientific | 06-666A | |
| formamide | Sigma Aldrich | 47670 | |
| microbalance | Denver Instrument | APX-60 | |
| microfuge tubes | Fisher Scientific | 07-200-534 | |
| polystyrene 96 well plate | Becton Dickenson | 351172 | |
| absorbance plate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| polyacrylamide gels | Bio-Rad | 3450014 | |
| protein molecular weight standard | Bio-Rad | 1610374 | |
| Protran supported nitrocellulose | Amersham (GE) | 10600015 | |
| gel box | Bio-Rad | 1658005 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tween20 | Sigma Aldrich | P-1379 | |
| sodium chloride | Fisher Scientific | S271-1 | |
| primary NEP polyclonal antibody | R & D Systems | AF1182 | |
| doxycycline chow | Teklad (HARLAN) | TD.130750 | |
| FVB/NJ wild type mice | Jackson | 001800 | |
| secondary antibody (goat anti-rabbit) | ZyMed | 81-6120 | |
| ECL solution-Western Lightening Plus | PerkinElmer | NEL104001EA | |
| film | Pierce | 34091 |
References
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