Her præsenterer vi en protokol for time-lapse billedbehandling og analyse af vasculogenesis i vitro bruger fase kontrast mikroskopi kombineret med open source-software, Kinetic analyse af Vasculogenesis. Denne protokol kan anvendes til at vurdere kvantitativt vasculogenic af mange celletyper eller forsøgsbetingelser, at model vaskulær sygdom.
Vasculogenesis er en kompleks proces hvorved endotelceller stamceller og stamfader gennemgå de novo fartoej formation. Kvantitativ vurdering af vasculogenesis er blevet en central udlæsning i endothelial stamfader celle funktionalitet, og derfor er sket adskillige forsøg på at forbedre både in vitro- og i vivo vasculogenesis modeller. Dog er standard metoder begrænset i omfang, med statiske målinger ikke at fange mange aspekter af denne yderst dynamisk proces. Derfor, målet om at udvikle denne nye protokol var at vurdere kinetik af in vitro- vasculogenesis for at kvantificere netværk dannelse og stabilisering, samt give indsigt i potentielle mekanismer bag vaskulære dysfunktion. Anvendelse af denne protokol er påvist ved hjælp af føtal endotel kolonidannende celler (ECFCs) udsættes for maternel diabetes mellitus. Fostrets ECFCs var afledt af navlestrengsblod efter fødslen, kulturperler og forgyldt i dias indeholdende basalmembranen matrix, hvor de blev vasculogenesis. Billeder af hele diaset brønde er anskaffet ved hjælp af time-lapse fase kontrast mikroskopi over 15 timer. Billeder blev analyseret for afledning af kvantitative data ved hjælp af en analyse software kaldet Kinetic analyse af Vasculogenesis (KAV). KAV bruger billedsegmentering efterfulgt af skeletonization til at analysere netværkskomponenter fra stakke af multi tid punkt fase kontrast billeder at udlede ti parametre (9 målt, 1 beregnet) af netværk struktur herunder: lukket netværk, netværksområder, noder, grene, samlede filial længde, gennemsnitlige filial længde, triple-forgrenede noder, quad-forgrenede noder, netværksstrukturer, og filialen at node forholdet. Anvendelse af denne protokol, identificeret ændres satserne for vasculogenesis i ECFCs fremstillet af graviditeter kompliceres af diabetes mellitus. Denne teknik har imidlertid bred konsekvenser ud over anvendelsesområdet rapporteret her. Gennemførelsen af denne tilgang vil forbedre mekanistiske vurdering og forbedre funktionelle udlæsninger af vasculogenesis og andre biologisk vigtige forgrenede processer i mange celletyper eller sygdom stater.
Evne i endothelial stamceller til at gennemgå vasculogenesis eller de novo fartoej formation, er kritiske i oprettelse af embryonale Vaskulaturen under udvikling1. Derudover er yderligere fartoej formation og modningen af præ-eksisterende fartøjer, der er kendt som angiogenese, også en vigtig proces i udvikling og postnatal liv at opretholde blodgennemstrømningen og homøostase i hele kroppen2. Hvert organ i kroppen er afhængig af det vaskulære system for levering af ilt og næringsstoffer, og fjernelse af affald3. Hvis vaskulære homeostase ikke er opretholdes, således at blodkar dannelse og reparation er enten utilstrækkelige eller overskydende, kan Vaskulære sygdomme medføre4. Derfor, vaskulære dannelse og tilpasning er almindeligt studerede, da de er afgørende i vedligeholdelse af organ sundhed og er involveret i udviklingen af talrige patologiske stater.
På grund af en øget forståelse for inddragelsen af det vaskulære system i udvikling og i sygdommen manifestation og progression, er assays blevet udviklet til model vasculogenesis og angiogenese in vitro og i vivo5 ,6,7. Modeling fartoej formation indebærer plating vaskulære celler, såsom endotelceller, i basalmembranen matrix, der fremmer celle organisation og dannelsen af fartøjet netværk8,9,10. Typisk følgende natten inkubation, billeder af cellen netværk er fanget på et enkelt tidspunkt, hvilket resulterer i et lille antal billeder til analyse11,12,13. Derfor, analytiske tilgange har i vid udstrækning blevet udviklet og optimeret til enkelt gang punkt vurderinger10,14. Men statiske analyser er simpelthen ikke tilstrækkelig til at opfange den dynamiske proces af fartoej formation og give begrænset indsigt i potentielle mekanismer involveret. Selvom imaging oftere vil sandsynligvis give de nødvendige data for at identificere dannelse kinetik, ville anvendelse af tidligere udviklet analytics til en multi tid punkt imaging fremgangsmåde være ineffektiv og labor intensiv14. Desuden, trods udviklingen af kommercielt tilgængelige analyser gør en pay-per-image gebyr denne indstilling cost-uoverkommelige for kinetiske undersøgelser, hvor tusindvis af billeder er genereret15. Derfor, der er behov for inden for en strømlinet og effektiv tilgang til fange og kvantificere vasculogenesis i vitro, herunder evnen til at analysere store billede sæt genereret af time-lapse levende celle mikroskopi.
For at overvinde disse begrænsninger, blev en ny tilgang udviklet med det formål at udvide enkelt tidspunkt imaging dynamisk vurdering af vasculogenesis med billeder erhvervet hver 15 min.16. Ved at erobre flere tidspunkter over flere timer, giver denne fremgangsmåde en mere detaljeret skildring af processen med vasculogenesis, samt indsigt i potentielle mekanismer bidrager til dannelsen og vedligeholdelse af fartøjet netværk. Ud over at forbedre hyppigheden og kvaliteten af billedet erhvervelse, omfatter denne tilgang roman software i form af en open-source plug-in17. Software, omtales som kinetisk analyse af Vasculogenesis (KAV), er en strømlinet program, der indeholder billedbehandling og analyse specielt til stort billede sæt genereret fra multi tid punkt erhvervelser. KAV analyserer fase kontrast billeder gennem billedsegmentering efterfulgt af skeletonization18. Ti parametre af netværksstruktur er kvantificeret ved KAV herunder: grene, lukkede netværk, noder, netværksområder, netværksstrukturer, triple-forgrenede noder, quad-forgrenede noder, samlede filial længde, gennemsnitlige filial længde og gren til node ratio (Se skematisk i figur 1)16. Anvendelsen af metoden med KAV omfatter en roman, beregnede Fænotypen af in vitro- vasculogenesis, benævnt filialen at node ratio. Vores seneste arbejde viste, at dette forhold er betegnende for netværksforbindelsen og kan være forbundet med andre cellulære processer involveret i nettet formation, såsom motilitet16.
Selv om føtal endotel kolonidannende celle (ECFC) vasculogenesis blev vurderet i disse undersøgelser, kan dette billede erhvervelse og analyse tilgang anvendes let for at evaluere alle celletyper, der undergår vasculogenesis eller angiogenese. Denne tilgang kan geometriprogrammet desuden bruges til at identificere ændrede vaskulære funktion som følge af en række patologiske stater, såsom svangerskabsuge diabetes mellitus, som vist i disse undersøgelser. Endvidere kan denne metode tilpasses for at vurdere netværk dannelse og forgrening, som er vigtige for andre biologisk relevante processer. Den potentielle effekt for at anvende denne nye fremgangsmåde for unikke biologiske systemer er således endnu skal fastlægges.
KAV muliggør evaluering af store datasæt med flere tidspunkter
Traditionelt har kvantitering af vasculogenesis in vitro- bestod af en enkelt eller et par gang punkt målinger. Denne statiske tilgang er simpelthen utilstrækkelige til at opfange og kvantificere en dynamisk og kompleks proces. Derfor, denne nye metode blev udviklet for at aktivere effektiv analyser af netværk dannelse kinetik at få indsigt i potentielle molekylære mekanismer involveret i den dynamiske proces med vasculogenesis. Effektivitet og automatisering er vigtige elementer i udviklingen af nye teknikker til at generere og analysere store mængder af billeddiagnostiske data. KAV blev udviklet specielt til at analysere store billedstakke består af hundredvis af billeder til at formindske den tid og arbejdskraft skal udlede biologisk meningsfulde konklusioner fra time-lapse datasæt. Vigtigere, KAV gennemfører billedbehandling og data generation i løbet af sekunder for lille (mindre end 100 billeder) billede stakke og minutter for større (mere end 100 billeder) billede stakke, hvilket resulterer i enestående effektivitet. Derudover muliggør data organisation i regneark af tid og parametre måles hurtige generation af grafisk præsentation og statistisk analyse.
Udfordringer i vellykket anvendelse af denne tilgang
Selv om dette assay indeholder forbedringer både image erhvervelse og analyse, kan nogle udfordringer hindre en vellykket gennemførelse. De fire vigtigste hindringer omfatter fugtighed stabilitet, timing præcision fra plating billede erhvervelse, software og hardware pålidelighed og forvaltning af store datasæt genereret for hvert forsøg. Stabil levende celle imaging over flere timer kan være udfordrende. Specifikt, kræves relevant og konsekvent befugtning for billeddiagnostiske afdelinger. Angiogenese dias er brugt i denne analyse, som er designet til parallelizing matrix-baserede angiogenese assays. Deres lav volumen, ca 50 µL, gør fordampning og kondensering betydelige overvejelser for udvidet kultur betingelser. For at bekæmpe denne eksperimentelle problem, er det nødvendigt at anvende en rugemaskine, der regulerer fugtighed. Det kan dog også være forpligtet til at forøge denne forordning, hvis overdreven tørring af imaging salen opstår over tid. Vi fandt, at det enkleste at øge luftfugtigheden er at øge vand areal i salen. For at opnå dette mål, vores protokol foreslår følgende tre vandkilder: et andet chambered dias fyldt med vand, som er også hvor inkubator temperaturen måles, vand i området omkring brøndene på dias, og fugtede filtrerpapir eller klude. Omvendt, kondens opstår når lufttemperaturen på værelset køler bunden af diaset og luftfugtighed inde i kammeret kondenserer på dias og brøndene. Denne komplikation kan føre til en udvanding af celle medier og en lensing effekt, der forstyrrer fasekontrast. I disse undersøgelser, blev kondens minimeret gennem anvendelse af opvarmet luft (39-42 ° C) på bunden af diaset.
En afgørende overvejelse for enhver time-lapse undersøgelse er sammenhængen mellem eksperiment indledning og billedbehandling. Tidspunktet for Hvornår imaging starter er kritisk fortolkning af downstream begivenheder. For at sikre timing præcisionen af denne analyse, bør tid mellem indledende plating og den første afbildet tidspunkt styres stramt. Denne “døde tid” kan minimeres i praksis, men endnu vigtigere, det skal være konsekvent at tillade eksperimenter på forskellige dage skal sammenlignes. For eksempel, i denne protokol forventer vi en døde tid på ca. 30 min.. Dette kan fremmes af nærhed af eksperimentelle forberedelse og imaging faciliteter.
Hvad kan synes som verdslige detaljer ved første øjekast er vigtige for software, hardware stabilitet og datastyring. Software og tilhørende hardware-drivere, netværksmiljø og automatiseret software opdateringer alle påvirker stabiliteten af softwaren. Det er værd at teste denne protokol i en “dry run” til at identificere flaskehalse og potentielle kilder til problemer i den billede erhvervelse for eksempel, kontrollere for upålidelige levende celle setup, fase, lukkertid og kamera pålidelighed og institutionelle information teknologi politikker på automatiseret operativsystem og programopdateringer.
Data management er en fortsat bekymring af enhver tænkelig eksperiment, der genererer hundreder til tusinder af billeder. Heldigvis, kommerciel software ofte kontrollerer for ledig plads før du starter en billeddannelse eksperiment. Denne analyse omfatter imidlertid også efter opsamling billedbehandling og analyse, der kan tilføje til skrap drive plads byrde og forstyrre imaging eksperimenter, hvis pladsen er begrænset. Yderligere, sikkerheden og stabiliteten i computeren kan ikke garanteres, selv med hardwareløsninger som en redundant array af identiske diske. Således er er et data management strategi for at sikre plads på computerens harddiske til igangværende forsøg og en robust remote arkivering, for eksempel med en institutionel arkivering ressource, nødvendige.
Strategier til at maksimere billedkvaliteten
Selv om KAV evne til præcist skelne ECFCs fra matrix baggrunden er robust, er følsomheden af analysen afhængig af billedkvaliteten. For eksempel, hvis billedet har lav kontrast, registrerer softwaren celle netværk med mindre nøjagtighed (figur 2B). Kvaliteten af fasekontrast er påvirket af flere faktorer, herunder indstillingerne for mikroskop bruges til billede erhvervelse, indlæsning af matrix og celle suspension medier under assay forberedelse og vedligeholdelse af medier niveauer i brøndene hele billeddannelse. For at optimere fasekontrast for disse assays, blev der foretaget mindre justeringer til fase ring justering i mikroskopet at forbedre kontrast. Derudover blev prøveforberedelse grundigt testet for at sikre lige og konsekvent medier lastning. Hvis mængden af matrix og/eller medie indlæses i brøndene er enten under eller over den optimale sortiment, kan en menisken danne fører til ændrede fasekontrast. Endelig, på grund af den lille mængde af flydende i brøndene, det er afgørende at opretholde medier ved at minimere fordampning og kondensering, som nævnt ovenfor. Samlet set er assay optimering afgørende for at skabe høj kvalitet kontrast billeder til analyse.
Ud over fase kontrast kvalitet, kan andre faktorer også indflydelse assay resultater herunder medier forurening, mangler i matrix, og partikler eller vragrester i matrix eller medier. Forurening er en fare i denne analyse, da det drejer sig om levende celle imaging over flere timer i en mikroskopi kammer. For at mindske risikoen for kontaminering, indlæses de matrix og celle suspensioner i diaset i en steril hætte. Derudover er hver prøve typisk forgyldt i to eller tre eksemplarer til et eksperiment at minimere risikoen for datatab på grund af uforudsete problemer som snavs eller partikler confounding analysen.
Prøven heterogenitet drev har brug for øget assay følsomhed
Heterogenitet er blevet observeret og rapporteret i tidligere undersøgelser af ECFCs udsat for GDM13. Et højt niveau af heterogenitet i cellefunktion observeret i disse prøver er spekuleret for at henføres til flere faktorer, herunder sværhedsgraden af moderens sygdom, varigheden af sygdom og ledelsesstil, der bruges til at regulere blodsukkerniveauet. Vigtigst, indfanger denne analytiske tilgang den dynamiske rækkevidde af ECFC vasculogenesis, hvilket gør det muligt at identificere fænotypiske forskelle på grund af funktionelle heterogenitet i prøver fra GDM graviditeter. Samlet set kan brug af primære patientprøver, som dem der bruges i disse undersøgelser, indføre større variation i forhold til en cellelinje. Som lægger større vægt på translationel undersøgelser der involverer flere primære dyrs eller menneskers prøver med funktionelle variabilitet, er assay følsomhed afgørende for registrering og afledning af biologisk meningsfuld målinger og konklusioner. Derfor, udvikling af metoder som KAV vil forbedre mængden og kvaliteten af data genereret af in vitro- vasculogenesis og angiogenese assays for at aktivere mere robust bemærkninger og konklusioner. Disse data vil desuden lette fremtidige undersøgelsen af underliggende molekylære mekanismer, der bidrager til ændrede ECFC vasculogenesis efter intrauterin GDM eksponering.
Fremtidige ansøgninger af denne tilgang
Selvom denne metode blev anvendt til at vurdere fosterets ECFC vasculogenesis in vitro- i disse undersøgelser, er de potentielle anvendelser af denne tilgang talrige. Denne teknik kan gennemføres let for at undersøge enhver celle befolkning, der deltager i processerne af vasculogenesis eller angiogenese. Specifikt, det kan bruges til at studere individuelle cellepopulationer, som blev demonstreret i denne undersøgelse, men det kunne også anvendes til fælles kultur systemer. I fremtiden vil det være gavnligt at udvide denne fremgangsmåde ud over todimensional i vitro assay at vurdere tredimensionale (3D) modeller. Selvom den aktuelle version af KAV ville være utilstrækkelig til quantitating 3D imaging data, ville en ligeledes designet time-lapse, multi parametrisk analytiske tilgang specifikt for 3D eller i vivo modeller informere hvis observationer foretaget i to-dimensioner in vitro- er repræsentant for cellefunktion i en mere biologisk relevante indstilling.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkender Lucy Miller, Leanne Hernandez, Dr. David Haas, Brittany Yeley (Indiana University School of Medicine), Dr. Karen Pollok, Julie Mund, Matthew Repass og Emily Sims (Angio BioCore på Indiana University Simon Cancer Center) for fremragende teknisk bistand i henhold til ECFC prøver. Forfatterne også anerkende Drs. Maureen A. Harrington, Edward F. Srour, Richard N. Day, Mervin C. Yoder og Matthias A. Clauss (Indiana University School of Medicine) for akademisk diskussion samt Janice vægge (Indiana University School of Medicine) for administrativ støtte. Alle tænkelig blev udført på Indiana Center for biologisk mikroskopi, Indiana University School of Medicine. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (R01 HL094725, P30 CA82709 og U10 HD063094) og Riley children’s Foundation. Derudover blev denne publikation muliggjort med delvis støtte fra National Heart, Lung og blod Institute for The National Institutes af sundhed under Award # T32 HL007910.
100mm Tissue Culture Plates | Fisher | 353003 | |
15ml conical tubes | Fisher | 1495949B | |
Angiogenesis 15-well micro-slides | Ibidi | 81506 | |
Matrigel | Fisher (Corning) | 354234 | |
EGM2 Medium | Lonza | CC3162 | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
PSA Antimyocytic, Antibiotic | Fisher | MT30004C1 | Added 5 milliliters per 500 milliter bottle of EGM2 medium. |
0.5% Trypsin/0.53nM EDTA in HBSS | Fisher (Corning) | MT25052CI | |
Type 1 Collagen | Fisher (Corning) | 354226 | 100mg of liquid, concentration range 3-4mg/mL. Dilute in 20nM acetic acid in ddH2O to use at a final concentration of 0.05mg/mL. |
Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Used in Type 1 Collagen solution at a final concentration of 20nM. |
Kim Wipes | Fisher | 06-666 | |
Chambered slide | Ibidi | 80296 | This slide can be filled with distilled water to maintain humidity in the imaging chamber. |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher (Gibco) | 20012027 | 1x solution, pH 7.2 |
Microscope | Nikon Instruments | MEA53100 and MEF55030 | Motorized TiE including Ph1 phase ring for phase contrast with objective |
Stage | Prior Instruments | ProScan II | Other OKOlab and Nikon Elements AR compatible stage may be used |
Objective | Nikon Instruments | 93178 | CFI Plan Fluor DL 10x |
Camera | Hamamatsu | C11440-42U | ORCA Flash 4.0LT |
Stage Blower | Precision Controls | N/A | This item has been discontinued, alternatives include Smart Air-Therm Heater(AIRTHERM-SMT-1W) from World Precision Instruments |
Stage-top Incubator | OKOLabs | H301 | BoldLine including a two position slide holder |
Computer | Hewlett-Packard | Z620 or equivalent | 4 core Intel Xeon processor, >32 GB RAM, >2 TB RAID 10, nVidia Quadro graphics card |
Nikon Elements Software | Nikon Instruments | AR v 4.20 | ND Acquisition is a multidimensional setup tool used to configure Elements software. |
FIJI (ImageJ) Software | N/A | N/A | Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
KAV Plug-In | N/A | N/A | Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis |