Här presenterar vi ett protokoll för time-lapse imaging och analys av vasculogenesis in vitro- använda fas kontrast mikroskopi tillsammans med öppen källkod, Kinetic analys av Vasculogenesis. Detta protokoll kan tillämpas för att bedöma kvantitativt vasculogenic potentialen i många celltyper eller experimentella förhållanden som modellerar vaskulär sjukdom.
Vasculogenesis är en komplex process som endotelceller stamceller och stamceller genomgå bildandet av blodkärl de novo . Kvantitativ bedömning av vasculogenesis har blivit en central avläsning av endothelial progenitor cell funktionalitet, och därför har det gjorts flera försök att förbättra både in vitro- och in-vivo vasculogenesis modeller. Dock är standardmetoder begränsad, med statiska mätningar misslyckas att fånga många aspekter av denna mycket dynamisk process. Mål att utveckla detta nya protokoll var därför att bedöma kineticsen av in vitro- vasculogenesis för att kvantifiera andelen nätverk bildas och stabilisering, samt ge insikt i potentiella mekanismerna bakom vaskulär dysfunktion. Tillämpningen av detta protokoll demonstreras med fostrets endothelial kolonibildande celler (ECFCs) utsätts för moderns diabetes mellitus. Fostrets ECFCs var härrör från navelsträngsblod efter födseln, odlade och klädd i bilder som innehåller basalmembranet matris, där de genomgick vasculogenesis. Bilder av hela bilden brunnarna förvärvades med time-lapse fas kontrast mikroskopi över 15 timmar. Bilder analyserades för härledning av kvantitativa data med hjälp av en analys programvara som kallas kinetisk analys av Vasculogenesis (KAV). KAV använder bild segmentering följt av skeletonization för att analysera nätverkskomponenter från högar av flera tid punkt fas kontrast bilder att härleda tio parametrar (9 mätt, 1 beräknas) av nätverket struktur inklusive: stängt nätverk, nätområden noder, grenar, totala grenlängd, genomsnittliga grenlängd, triple-Grenade noder, quad-Grenade noder, nätstrukturer och vägskälet till nod baserat. Tillämpningen av detta protokoll identifierade förändrade priser av vasculogenesis i ECFCs erhålls från graviditeter kompliceras av diabetes mellitus. Denna teknik har dock bred konsekvenser utöver redovisas här. Genomförandet av denna strategi kommer att förbättra mekanistiska bedömning och förbättra funktionsavläsningar vasculogenesis och andra biologiskt viktiga förgrenade processer i många celltyper eller sjukdomstillstånd.
Förmågan av endothelial stamceller genomgå vasculogenesis eller bildandet av blodkärl de novo , är kritisk i upprättandet av embryonala vaskulatur under utveckling1. Dessutom är ytterligare bildandet av blodkärl och mognaden av redan existerande fartyg, som kallas angiogenes, också en viktig process i utvecklingen och i postnatal liv att upprätthålla blodflödet och homeostas i hela kroppen2. Varje organ i kroppen är beroende av det vaskulära systemet för leveransen av syre och näringsämnen, och avlägsnande av avfall3. Om kärl homeostas inte upprätthålls, sådana att blodkärlsbildning och reparation är otillräcklig eller i överskott, kan vaskulära sjukdomar leda4. Därför, vaskulär bildandet och anpassning ofta studeras, eftersom de är nödvändiga för underhållet av organ hälsa och är inblandade i utvecklingen av ett flertal patologiska stater.
På grund av en ökad förståelse för medverkan av kärlsystemet i utveckling, liksom i sjukdom manifestation och progression, har analyser utvecklats till modell vasculogenesis och angiogenes in vitro och i vivo5 ,6,7. Modeling bildandet av blodkärl involverar plätering vaskulära celler, såsom endotelceller, i basalmembranet matris som främjar cell organisation och bildandet av fartyget nätverk8,9,10. Normalt följande natten inkubation, bilder av cellen nätverk fångas vid en enda tidpunkt, vilket resulterar i ett litet antal bilder för analys11,12,13. Analytiska metoder har därför till stor del utvecklats och optimerad för enkel tid punkt bedömningar10,14. Dock statiska analyser är helt enkelt otillräckliga på att fånga den dynamiska processen för bildandet av blodkärl och ger begränsad insikt om potentiella mekanismer som är involverade. Trots ökande imaging frekvens skulle sannolikt ge nödvändiga uppgifter för att identifiera bildandet kinetik, skulle tillämpningen av tidigare utvecklade analytics till en multi tid punkt imaging strategi vara ineffektivt och labor intensiv14. Dessutom, trots utveckling av kommersiellt tillgängliga analyser återger en pay-per-image avgift detta alternativ kostnad oöverkomliga för kinetiska studier där tusentals bilder är genererade15. Därför finns det ett behov i området för ett rationellt och effektivt förhållningssätt till fånga och kvantifiera vasculogenesis in vitro-, inklusive förmågan att analysera stora bild-apparater som genereras av time-lapse levande cell mikroskopi.
För att övervinna dessa begränsningar, utvecklades en ny strategi med syfte att utöka enda tidpunkt imaging möjliggör dynamisk bedömning vasculogenesis med bilder förvärvade varje 15 min16. Genom att fånga flera tidpunkter under flera timmar, ger detta tillvägagångssätt en mer detaljerad skildring av processen av vasculogenesis, samt insikt i potentiella mekanismer bidrar till bildandet och underhållet av fartyget nät. Förutom att förbättra frekvens och kvalitet av bild förvärvandet, innehåller detta tillvägagångssätt roman programvara i form av en öppen källkod plug-in17. Programvaran, avses som Kinetic analys av Vasculogenesis (KAV), är en strömlinjeformad program som innefattar bildbehandling och analys speciellt för stora bild-apparater som genereras från flera tid punkt förvärv. KAV analyserar fas kontrast bilder genom bild segmentering följt av skeletonization18. Tio parametrar av nätverksstrukturen kvantifieras av KAV inklusive: grenar, slutna nätverk, noder, nätverksareor, nätstrukturer, triple-Grenade noder, quad-Grenade noder, totala grenlängd, genomsnittliga grenlängd och vägskälet till nod baserat (se schematiskt i figur 1)16. Tillämpningen av KAV-metoden innehåller en roman, beräknade fenotyp av in vitro- vasculogenesis, kallad grenen nod-förhållande. Vårt senaste arbete visade att detta förhållande är vägledande för nätverksanslutning och kan vara associerad med andra cellulära processer som är involverade i bildandet av nätverk, såsom motilitet16.
Även om fostrets endothelial kolonibildande cell (ECFC) vasculogenesis bedömdes i dessa studier, kan denna bild förvärv och analys lätt tillämpas för att utvärdera alla celltyper som genomgår vasculogenesis eller angiogenes. Detta tillvägagångssätt kan dessutom användas för att identifiera förändrad vaskulär funktion följd en mängd patologiska stater, såsom graviditetsdiabetes diabetes mellitus, som visas i dessa studier. Denna metod kan dessutom anpassas för att bedöma nätverk bildas och förgreningar, som är viktiga för andra biologiskt relevanta processer. Den potentiella effekten av att tillämpa detta nya tillvägagångssätt att unika biologiska system alltså ännu skall fastställas.
KAV möjliggör utvärdering av stora datamängder med flera tidpunkter
Traditionellt har kvantitering av vasculogenesis in vitro- bestod av en enda eller några tid punkt mätningar. Denna statiska strategi är helt enkelt otillräckliga för att fånga och kvantifiera en dynamisk och komplex process. Därför utvecklades denna nya metod för att möjliggöra effektiva analyser av nätverket bildandet kinetik att få insikt i potentiella molekylära mekanismer som är involverade i den dynamiska processen för vasculogenesis. Effektivitet och automatisering är viktiga komponenter i utvecklingen av nya tekniker för att generera och analysera stora mängder imaging data. KAV utvecklades speciellt för att analysera stora bildstaplar bestående av hundratals bilder att minska tid och arbetskraft som krävs för att härleda biologiskt meningsfulla slutsatser från time-lapse datauppsättningar. Ännu viktigare, KAV bedriver bildbehandling och data generation i några sekunder för små (mindre än 100 bilder) bild stackar och minuter för större (mer än 100 bilder) bildstaplar, vilket resulterar i oöverträffad effektivitet. Data organisationen in i kalkylblad av tid och uppmätta parametrar kan dessutom snabb generering av grafisk presentation och statistisk analys.
Utmaningar i framgångsrik tillämpning av denna metod
Även om denna analys innehåller förbättringar både bild förvärv och analys, kan några utmaningar hindra framgångsrikt genomförande. De fyra viktigaste hindren inkluderar luftfuktighet stabilitet, timing precision från bordläggningen till bild förvärvandet, programvara och maskinvara tillförlitlighet och hantering av stora datamängder som genereras för varje experiment. Stabil levande cell imaging under flera timmar kan vara utmanande. Särskilt krävs lämpliga och konsekventa befuktning för imaging kamrarna. Angiogenes bilder används i denna analys, som är avsedda för parallelizing matrix-baserade angiogenes analyser. Deras låg volym, ca 50 µL, gör avdunstning och kondensation betydande överväganden för utökade odlingsbetingelser. För att bekämpa problemet experimentellt, är det nödvändigt att använda en inkubator som reglerar luftfuktighet. Dock kan det också krävas att öka denna förordning om stark uttorkning av imaging kammaren inträffar över tiden. Vi hittade att det enklaste sättet att öka luftfuktigheten är att öka vatten yta i kammaren. För att uppnå detta mål, våra protokoll föreslår följande tre vattenkällor: en andra kamrar bild fylld med vatten, som är också där inkubator temperaturen mäts, vatten i området kring brunnarna på diabilder och fuktade filterpapper eller våtservetter. Däremot uppstår kondens när lufttemperaturen i rummet kyler botten av bilden och luftfuktigheten inne i kammaren kondenserar på bilderna och brunnarna. Denna komplikation kan leda till en utspädning av cell media och en lensing effekt som stör faskontrast. I dessa studier var kondens minimeras genom tillämpning av uppvärmd luft (39-42 ° C) på undersidan av bilden.
En nyckelfråga för någon time-lapse studie är överensstämmelsen mellan experiment initiering och imaging. Tidpunkten för när imaging startar är avgörande för tolkningen av efterföljande händelser. För att säkerställa timing precisionen i denna analys, ska tiden mellan första plätering och den första avbildade tidpunkten kontrolleras noggrant. I praktiken detta ”dödtid” kan minimeras, men ännu viktigare, det måste vara konsekvent att tillåta experiment på olika dagar kan jämföras. Exempelvis i detta protokoll förväntar vi oss en döda tid av cirka 30 min. Detta kan underlättas av närheten av experimentella förberedelse och imaging faciliteter.
Vad kan tyckas vara vardagliga detaljer vid första anblicken är viktiga för programvara, maskinvara stabilitet och datahantering. Programvaran och tillhörande maskinvarudrivrutiner, nätverksmiljö och automatiserad programvara uppdaterar alla påverkar stabiliteten i programvaran. Det är värt att testa detta protokoll i en ”torr kör” att identifiera flaskhalsar och potentiella felkällor i bild förvärv; till exempel kontrollera för opålitliga levande cell setup, scenen, slutaren och kamera tillförlitlighet och institutionella informationshanteringsprinciperna teknik för automatiserad operativsystem och programuppdateringar.
Datahantering är en pågående oro av någon tänkbar experiment som genererar hundratals till tusentals bilder. Lyckligtvis, kommersiell programvara ofta kontrollerar för tillgängligt utrymme före start ett imaging experiment. Denna assay innehåller emellertid också post-Capture bildbehandling och analys som kan lägga till hårddisk utrymme bördan och störa imaging experiment, om utrymmet är begränsat. Ytterligare, säkerheten och stabiliteten i datorn kan inte garanteras, även med maskinvarulösningar som en redundant array av identiska diskar. Således, en data management strategi att säkerställa utrymme på datorns hårddiskar för pågående experiment och en robust remote arkivering, exempelvis med en institutionell arkivering resurs, är nödvändigt.
Strategier för att maximera bildkvaliteten
Även om KAV förmåga att urskilja exakt ECFCs från matrix bakgrunden är robust, är analysens känslighet beroende av bildkvalitet. Till exempel om bilden har låg kontrast, kommer att mjukvaran upptäcka mobilnätverk med mindre noggrannhet (figur 2B). Kvaliteten på fas kontrasten påverkas av flera faktorer, inklusive inställningarna för mikroskopet används för bild förvärv, lastning av matrisen och cell suspension media under assay förberedelser, och underhåll av media nivåer inom brunnarna hela imaging. För att optimera fas kontrasten för dessa analyser, gjordes mindre justeringar till fas ring justering i mikroskopet att förbättra kontrast. Dessutom var provberedning noggrant testade för att säkerställa lika och konsekvent media lastning. Om mängden matris eller media laddas i brunnar är antingen nedanför eller ovanför spektrometerns optimala mätområde, kan en menisk bilda leder till förändrad faskontrast. Slutligen, på grund av den lilla volymen av vätska i brunnarna, det är viktigt att upprätthålla media nivåer genom att minimera avdunstning och kondensation, som nämnts ovan. Sammantaget är assay optimering avgörande för att skapa högkvalitativa bilder med kontrast för analys.
Utöver fas kontrast kvalitet, kan andra faktorer också påverka analysens resultat inklusive media kontaminering, brister i matrisen, och partiklar eller skräp i matrisen eller media. Kontaminering är en fara för denna analys eftersom det innebär levande cell imaging under flera timmar i en mikroskopi kammare. För att minska risken för kontamination, lastas matrix och cell upphängningarna på bilden i en steril huva. Varje prov är dessutom vanligtvis klädd i två eller tre exemplar för ett experiment för att minimera risken för dataförlust på grund av oförutsedda problem som skräp eller partiklar confounding analysen.
Prov heterogenitet enheter behöver för ökad analysens känslighet
Heterogenitet har observerats och rapporterats i tidigare studier av ECFCs som exponeras för GDM13. En hög nivå av heterogenitet i cell-funktion som observerats i dessa prover är spekulera till vara hänförligt till flera faktorer, inklusive svårighetsgraden av moderns sjukdom, sjukdom, och ledarstil som används för att reglera blodsockernivåerna. Allt fångar detta analytiska tillvägagångssätt den dynamiska sortiment av ECFC vasculogenesis, vilket gör det möjligt att identifiera fenotypiska skillnader på grund av funktionella heterogenitet i prover från GDM graviditeter. Användning av primära patientprover, såsom de som används i dessa studier kan sammantaget införa större variabilitet jämfört med en cellinje. Större betoning på translationella studier på djur eller människa flera delprov med funktionella variabilitet, är analysens känslighet viktigt för att upptäcka och härledning av biologiskt meningsfull mätningar och slutsatser. Därför, utveckling av strategier som KAV kommer att förbättra kvantiteten och kvaliteten på data som genereras av in vitro- vasculogenesis och angiogenes analyser för att möjliggöra mer robust observationer och slutsatser. Dessa data kommer dessutom att underlätta framtida utredning av underliggande molekylära mekanismer som bidrar till förändrad ECFC vasculogenesis efter intrauterin GDM exponering.
Framtida tillämpningar av denna strategi
Även om denna metod användes för att bedöma fostrets ECFC vasculogenesis in vitro- i dessa studier, är de potentiella tillämpningarna av detta tillvägagångssätt många. Denna teknik kan lätt genomföras för att studera någon cell befolkningen som deltar i processerna av vasculogenesis eller angiogenes. Specifikt, det kan användas för att studera enskilda cellpopulationer, vilket visades i denna studie, men det skulle också kunna tillämpas på samtidig kultur system. I framtiden, skulle det vara fördelaktigt att expandera denna strategi bortom den tvådimensionella i vitro assay att bedöma tredimensionella (3D) modeller. Även om den aktuella versionen av KAV skulle vara otillräcklig för quantitating 3D-avbildning data, skulle en Likaså utformade time-lapse, multi parametriska analytisk metod speciellt för 3D eller i vivo modeller informera om observationer gjorda i två dimensioner in vitro- är representativa för cellens funktion i en mer biologiskt relevant miljö.
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänner Lucy Miller, Leanne Hernandez, Dr David Haas, Brittany Yeley (Indiana University School of Medicine), Dr. Karen Pollok, Julie Mund, Matthew Repass och Emily Sims (Angio BioCore vid Indiana University Simon Cancer Center) för Utmärkt teknisk assistans i härleda ECFC prover. Författarna också erkänna Drs. Maureen A. Harrington, Edward F. Srour, Richard N. Day, Mervin C. Yoder och Matthias A. Clauss (Indiana University School of Medicine) för vetenskaplig diskussion samt Janice väggar (Indiana University School of Medicine) för administrativt stöd. Alla imaging utfördes på Indiana Center för biologiska mikroskopi, Indiana University School of Medicine. Detta arbete stöds av National Institutes of Health (R01 HL094725, P30 CA82709 och U10 HD063094) och Riley Children’s Foundation. Dessutom, möjliggjordes denna publikation med delvis stöd från nationella hjärta, lungor och blod institutet av The National Institutes of Health under Award # T32 HL007910.
100mm Tissue Culture Plates | Fisher | 353003 | |
15ml conical tubes | Fisher | 1495949B | |
Angiogenesis 15-well micro-slides | Ibidi | 81506 | |
Matrigel | Fisher (Corning) | 354234 | |
EGM2 Medium | Lonza | CC3162 | |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
PSA Antimyocytic, Antibiotic | Fisher | MT30004C1 | Added 5 milliliters per 500 milliter bottle of EGM2 medium. |
0.5% Trypsin/0.53nM EDTA in HBSS | Fisher (Corning) | MT25052CI | |
Type 1 Collagen | Fisher (Corning) | 354226 | 100mg of liquid, concentration range 3-4mg/mL. Dilute in 20nM acetic acid in ddH2O to use at a final concentration of 0.05mg/mL. |
Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-212 | Used in Type 1 Collagen solution at a final concentration of 20nM. |
Kim Wipes | Fisher | 06-666 | |
Chambered slide | Ibidi | 80296 | This slide can be filled with distilled water to maintain humidity in the imaging chamber. |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher (Gibco) | 20012027 | 1x solution, pH 7.2 |
Microscope | Nikon Instruments | MEA53100 and MEF55030 | Motorized TiE including Ph1 phase ring for phase contrast with objective |
Stage | Prior Instruments | ProScan II | Other OKOlab and Nikon Elements AR compatible stage may be used |
Objective | Nikon Instruments | 93178 | CFI Plan Fluor DL 10x |
Camera | Hamamatsu | C11440-42U | ORCA Flash 4.0LT |
Stage Blower | Precision Controls | N/A | This item has been discontinued, alternatives include Smart Air-Therm Heater(AIRTHERM-SMT-1W) from World Precision Instruments |
Stage-top Incubator | OKOLabs | H301 | BoldLine including a two position slide holder |
Computer | Hewlett-Packard | Z620 or equivalent | 4 core Intel Xeon processor, >32 GB RAM, >2 TB RAID 10, nVidia Quadro graphics card |
Nikon Elements Software | Nikon Instruments | AR v 4.20 | ND Acquisition is a multidimensional setup tool used to configure Elements software. |
FIJI (ImageJ) Software | N/A | N/A | Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
KAV Plug-In | N/A | N/A | Free, open-source software dowloaded online at the following URL: https://github.com/icbm-iupui/kinetic-analysis-vasculogenesis |