Denne protokol er rettet mod bestemte celler i vævet til billedbehandling på nanoskala opløsning ved hjælp af en scanning elektron mikroskop (SEM). Stort antal serielle sektioner fra harpiks-embedded biologisk materiale er først afbildet i en lys mikroskop til at identificere målet og derefter i en hierarkisk måde i SEM.
Rettet mod specifikke celler på ultrastrukturelle beslutning inden for en blandet celle population eller en væv kan opnås ved hierarkisk imaging ved hjælp af en kombination af lys og elektronmikroskopi. Prøver indkapslet i harpiks er opdelt i arrays bestående af bånd af hundredvis af ultratynde sektioner og deponeret på stykker af silicium wafer eller conductively belagt coverslips. Arrays er afbildet med lav opløsning ved hjælp af en digital forbruger som din smartphone kameraet eller lysmikroskop (LM) for en hurtig stort område oversigt eller et bredt felt fluorescens mikroskop (Fluorescens lysmikroskopi (FLM)) efter mærkning med fluorophores. Efter efter farvning med tungmetaller, er arrays afbildet i en scanning elektron mikroskop (SEM). Udvælgelse af mål er muligt fra 3D rekonstruktioner genereret af FLM eller 3D rekonstruktioner fremstillet af SEM billedstakke på mellemliggende opløsning, hvis ingen fluorescerende markører er tilgængelige. Ultrastrukturelle analyse, valgte mål er endelig optaget i SEM ved høj opløsning (nogle få nanometer billedpixel). En bånd-håndtering værktøj, der kan eftermonteres til enhver ultramicrotome er påvist. Det hjælper med array produktion og substrat fjernelse fra skære kniv båden. En softwareplatform, der tillader automatiseret billedbehandling af arrays i SEM’EN er diskuteret. Sammenlignet med andre metoder, generere store bind EM data, såsom seriel blok-ansigt SEM (SBF-SEM) eller fokuseret ion beam SEM (FIB-SEM), denne tilgang har to store fordele: (1) harpiks-embedded prøven er bevaret, omend i en skåret version. Det kan være farvet på forskellige måder og afbildet med forskellige opløsninger. (2) som afsnittene kan farves post, er det ikke nødvendigt at bruge prøver stærkt blok-farves med tungmetaller til at indføre kontrast til SEM imaging eller gøre vævet blokke ledende. Dette gør metoden anvendes til en bred vifte af materialer og biologiske spørgsmål. Især lovbefalede materialer fx, fra biopsi banker og patologi labs, kan direkte være indlejret og rekonstrueret i 3D.
Rekonstruere store mængder af væv ultrastrukturelle opløsning på en række forskellige Billeddannende metoder baseret på SEM har været brugt1: omfattende anmeldelser er tilgængelige fx., SBF-SEM2, FIB-SEM3og Array Tomografi (AT)4. Mens for sidstnævnte metode prøvematerialet er bevaret som en matrix af serielle sektioner på et substrat, er SBF-SEM og FIB-SEM destruktive metoder, arbejder på prøve blok og indtager under imaging. På grund af opladning af harpiks i SEM, afhænger de også kraftigt metalliseret prøve blokke5.
På den anden side kan at identificere bestemte celler eller strukturer af interesse inden for en vævsprøve drage særlig fra korrelationsmaalinger lys og elektronmikroskopi (CLEM)6,7,8. Ved hjælp af FLM for målretning udelukker anvendelsen af store mængder tungmetal da dette ville slukke fluorescens signal9. Til prøverne kun lidt metalliseret er på den foretrukne metode da arrays kan nemt være post farves med heavy metal efter LM billeddannelse. Desuden næsten alle prøvetypen kan bruges til AT, selv rutinemæssige prøver fra patologs treasure chest10.
En anden stor fordel ved AT er potentialet for hierarkisk11 eller multi-resolution imaging12: det er ikke nødvendigt at billedet alt i høj opløsning, da mål kan vælges i en anden modalitet (fxFLM) eller i billeder i lav opløsning SEM. Imaging kun de interessante områder i en vævs- eller befolkning på høj opløsning gemmer digitale data opbevaringsplads og producerer mindre billede datasæt, som er lettere at håndtere. Her, AT arbejdsprocessen er påvist ved hjælp af en temmelig svagt metalliseret prøve: højtryk frosne planternes rødder (Arabidopsis thaliana) indlejret i hydrofile harpiks.
Hvordan arrays er forberedt, farves, og afbildet i både FLM og SEM, og hvordan billedstakke er registreret er forklaret. Også, hvordan den 3D rekonstruktion af FLM volumen kan bruges til at vælge specifikke celler for billeddannelse i SEM på nanoskala opløsning er illustreret.
En arbejdsproces til at målrette specifikke celler i et væv af multimodale hierarkisk på blev demonstreret: en resin integreret prøve er skåret i arrays af serielle sektioner, som er placeret på en ledende substrat ved hjælp af en specialdesignet substrat indehaveren. Efter mærkning med en fluorophore og imaging i FLM, bruges den rekonstruerede volumen for at vælge target-cellerne. Efter yderligere farvning runder med tungmetaller at indføre kontrast, er disse mål afbildet i løbet flere hundrede sektioner på nanoskala opløsning i en SEM ved hjælp af en automatiseret softwareplatform.
For at producere tætpakkede matrixer med flere lange bånd, er et substrat indehaveren svarende til den, der er beskrevet her nødvendige. En dygtig og tålmodig person kan muligvis tillægger en silicium substrat, semi-nedsænket i båden kniv flere bånd og hente vifte af gradvist sænke vandstanden indtil båndene sidder på underlaget. Men i den erfaring, der er en tendens til at splintre dannelse når substratet er at røre ved nogen del af kniv båd (jf. note i 1.3.2 i protokollen). Denne procedure er derudover meget vanskeligere med ITO-belagt substrater: (1) som følge af gennemsigtigheden af ITO-glas, det er svært at se kanten af vandet hvor enderne af båndene skal knyttes; og (2) fordi den ITO-belagt overflade er meget grovere end den blankpolerede silicium wafer, bånd har tendens til at bryde under lift-out og mindre fragmenter bestående af et par sektioner kan flyde, dermed ødelægger rækkefølgen af sektionerne.
Den hele arbejdsproces er også mulig uden korrelation til FLM data. I dette tilfælde kan dataindsamling i SEM skulle udføres i flere sessioner. En indledende 3D rekonstruktion eller i det mindste evalueringen af lav eller medium opløsning data kan være nødvendigt at identificere mål. Derudover kan konventionelle histologiske pletter for brightfield LM (ikke kræver FLM) anvendes. Andre indstillinger for6,7,8 er naturligvis antistof mærkning på arrays, som allerede demonstreret i den oprindelige papir på kl18, eller genetisk kodet fluorescerende proteiner (XFPs) eller pre indlejring mærkning med bevarelse af fluorescens under forberedelse af prøver.
En generel begrænsning af den omtalte metode er brugen af dele af visse tykkelse og deraf følgende diskrete prøveudtagning af 3D-versionen: opløsning i Z kan kun være så god som tykkelsen af sektionerne, da SEM indsamler kun data fra afsnit overflade (d epending på den primære energi/landing energi valgt). Det betyder, at den resulterende 3D volumen anisotrope voxels, fx., 5 x 5 x 100 nm3 hvis 100 nm sektioner og et billede pixelstørrelse af 5 nm anvendes. For meget små enheder i en størrelsesområde under 1 µm, kan dette ikke være tilstrækkeligt for en ægte ultrastrukturelle beskrivelse. En mere teknisk begrænsning er nøjagtigheden af stadiet anvendes i SEM’EN til automatiseret billedbehandling. På grund af dette er det nødvendigt at vælge en ROI større end specifikationerne for fase nøjagtighed at sikre, at fuld målområdet er afbildet.
Sammenlignet med SBF-SEM og FIB-SEM som blok-ansigt Billeddannende metoder, har korrelationsmaalinger AT den endelige ulempe af anisotrope voxels, som beskrevet ovenfor. Med FIB-SEM, kan isotropic voxels 5 x 5 x 5 nm3 opnås ved en ordentlig drift korrektion er på plads.
Huller i den rekonstruerede volumen på grund af tab af dele under forberedelse af arrays kan også være et anliggende, der ikke er stødt på med SBF-SEM eller FIB-SEM. Med god bånd stabilisering af lim, dette er normalt kun et problem for det sidste afsnit af et bånd: det kan blive beskadiget, når frigiver det fra knivsæg ved hjælp af øjenvipper. Imidlertid vores erfaring påvirke tabet af én sektion i hver 20 – 50 sektioner ikke billede registrering.
På den anden side giver mulighed for at post pletten arrays godt signal og kontrast for SEM imaging, selv om svagt metalliseret prøver såsom højtryk frosne roden tips vist her. Det er derfor ikke nødvendigt at kompromittere optimal ultrastrukturelle bevarelse af talrige kemisk fiksering og metallization trin. Også, rutinemæssige prøver fra patologi laboratorium med mellemliggende grader af metallization levere fremragende data10. Sådan en post indlejring kontrastforbedring er ikke muligt for SBF-SEM og FIB-SEM i almindelighed. Desuden, da disse metoder er destruktiv, dvs, forbrugende prøven under imaging, hierarkisk imaging på forskellige opløsninger og websteder eller gentagne imaging på senere punkter i tid er umuligt. I princippet ubegrænset diskenheder, bestående af store FOVs (f.eks.op til flere millimeter for hele musen hjerner i connectomics) lavet af syninger mosaikker og enorme antal sektioner kan erhverves af på, mens i FIB-SEM, FOVs ud over 100 µm x 100 µm er vanskelige at nå med rutinemæssig instrumenter.
Yderligere automatisering af arbejdsprocessen til beskrevet AT ville være en klar fordel, da de ovennævnte metoder SBF-SEM og FIB-SEM udføre både skæring og imaging inden for samme instrument i en fuldt automatiseret måde. En form for automatisering af skæring eksisterer: The ATUMtome12 kan generere og indsamle tusindvis af sektioner, men brugen af Kapton tape som et substrat gør sådan arrays vanskeligt at billedet i en FLM. På den ITO-belagt coverslips anvendes her, bør endda super-resolution imaging være muligt. Et yderligere, meget ønskeligt mål for automation ville være optagelse af datastakke FLM. På den anden side automation kan være dyrt og er bortset fra indehaveren substrat arbejdsprocessen præsenteres her afhængig (for hardware) kun instrumentation normalt tilgængelige i en rutinemæssig EM laboratorium eller core facilitet, hvilket gør det lave niveau adgang.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud FKZ 13GW0044 fra det tyske Forbundsministerium for uddannelse og forskning, projekt MorphiQuant-3D. Vi takker Carolin Bartels for teknisk support.
Instrumentation | |||
Ultramicrotome | RMC | PT-PC | Alternative: Leica UC7 |
Substrate holder | RMC | ASH-100 | Alternative: home built |
Plasma cleaner | Diener | Zepto 40kHz | Alternatives: Ted Pella Pelco or other benchtop plasma cleaner Example Parameters for Diener Zepto with 40kHz generator (0-100W); 0.5 mbar, 5 sccm (Air), 10% performance |
Widefield fluorescence light microscope | Zeiss | Axio Observer.Z1 | Alternatives: Leica, Nikon, Olympus |
Fluorescence filter set | Zeiss | 43 HE (Cy3/DsRed) | |
Objective lens | Zeiss | Zeiss Neofluar 40x | 0.75 NA |
Decent workstation able to handle GB-sized image data | |||
FESEM | Zeiss | Ultra 55 | Alternatives: FEI, Jeol, Hitachi, TESCAN |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Sectioning | |||
Razor blades | Plano | T585-V | |
Diamond knife for trimming 45° | Diatome | DTB45 | |
Diamond knife for trimming 90° | Diatome | DTB90 | |
Jumbo diamond knife for sectioning | Diatome | DUJ3530 | |
Silicon wafer (pieces) | Si-Mat | Custom Made | Doping: P/Bor, orientation: <100>, thickness: 525 ± 25 µm, resistivity: 1-30 Ω-cm http://si-mat.com/silicon-wafers.html |
ITO-coated coverslips | Balzers | Type Z | 22 × 22 × 0.17 mm https://www.opticsbalzers.com/de/produkte/deckglas-fenster/corrslide.html |
Aluminium carrier | Custom Made | 76 × 26 mm | |
Wafer forceps | Ideal-tek | 34A.SA | |
Stubs forceps | Dumont | 0103-2E1/2-PO-1 | Dumoxel-H 2E 1/2 |
Diamond scriber | Plano | T5448 | |
Eyelash/very soft cat's hair | Selfmade | Alternative: Plano | |
Brush | Selfmade | ||
Pattex contact adhesive | Pattex | PCL3C | Kraftkleber Classic (the yellowish one) |
Fixogum | Marabu | 290110001 | for fixing substrate to carrier |
Adhesive tape | 3M | 851 | for fixing substrate to carrier |
Isopropanol | Bernd Kraft | 07029.4000 | |
Xylene | Carl Roth | 4436 | thinner for glue mixture |
Rotihistol | Carl Roth | 6640 | alternative, limonene based thinner |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Image processing | Open source | Fiji (http://fiji.sc/#download) | |
Image acquisition | Zeiss | Atlas 5 AT (module for Zeiss SEM) |
Alternative for automated image acquisition: WaferMapper: https://software.rc.fas.harvard.edu/lichtman/LGN/WaferMapper.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Staining | |||
Propidiumiodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Stock solution: 1.5 mM in 0.1 % sodium azide |
Uranylacetate | Science Services | E22400 | |
Lead(II) Nitrate | Merck | 107398 | |
Tri Sodium Citrate Dihydrate | Merck | 106448 | |
NaOH pellets | Merck | 106469 | |
1M NaOH solution | Bernd Kraft | 01030.3000 | |
Glass petri dish | Duran | 23 755 56 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Mounting | |||
Stubs | Plano | G301F | |
Carbon pads | Plano | G3347 | |
Copper tape | Plano | G3397 | double-sided adhesive, conductive |
Silver paint | Plano | G3692 | Acheson Elektrodag 1415M |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions/mixtures | |||
Adhesive mixture for coating blocks | Pattex contact adhesive /xylene as thinner, ratio 1:3. (Alternative for xylene: Rotihistol) |
||
Reynolds lead citrate | 50 mL: Dissolve 1.33 g of lead(II) nitrate in 10 mL of dH2O. Dissolve 1.76 g of tri-sodium citrate dihydrate in 10 ml dH2O. Mix both and add 1 M sodium hydroxide until the solution is clear. Fill up with dH2O to 50 mL. |
||
Propidium iodide staining solution | Prepare 1:1500 dilution from stock in dH2O. Vortex for adequate mixing. |
||
Aqueous uranyl acetate | Dissolve 3 % uranyl acetate in dH2O (mix thoroughly). |