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Immunology and Infection

साइट उत्पंन करने के लिए एक सतही प्रोटोकॉल-विशेष रूप से ई कोलाई में Acetylated प्रोटीन

Published: December 09, 2017
doi:
10.3791/57061
, , , ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,University of Arkansas, 2Cell and Molecular Biology Program,University of Arkansas, 3Department of Biological Sciences,University of Arkansas, 4Fayetteville High School

Summary

आनुवंशिक कोड विस्तार प्रोटीन acetylation सहित जैविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में कार्य करता है । यहाँ हम एक सतही प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करने के लिए इस तकनीक का दोहन करने के लिए विशिष्ट साइटों में homogeneously acetylated प्रोटीन पैदा करने के लिए ई कोलाई कोशिकाओं.

Abstract

प्रोटीन के विशिष्ट पदों पर होने वाले पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों में सेलुलर प्रक्रियाओं की एक किस्म में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए दिखाया गया है । उनमें से, प्रतिवर्ती lysine acetylation सबसे व्यापक रूप से जीवन के सभी डोमेन में वितरित में से एक है । हालांकि कई मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित acetylome अध्ययन किया गया है, इन ख्यात acetylation लक्ष्य के आगे लक्षण वर्णन सीमित किया गया है । एक संभावित कारण यह है कि यह सबसे क्लासिक जैव रासायनिक दृष्टिकोण से वांछित पदों पर विशुद्ध रूप से acetylated प्रोटीन उत्पंन करने के लिए मुश्किल है । इस चुनौती को दूर करने के लिए, आनुवंशिक कोड विस्तार तकनीक को एक इंजीनियर pyrrolysyl-tRNA synthetase वैरिएंट की जोड़ी का उपयोग करने के लिए लागू किया गया है, और इसके cognate tRNA से Methanosarcinaceae प्रजातियों, cotranslational को प्रत्यक्ष करने के लिए ब्याज की प्रोटीन में विशिष्ट साइट पर acetyllysine की । citrullinated acetylation के अध्ययन में पहले आवेदन के बाद, इस दृष्टिकोण प्रोटीन की एक किस्म पर acetylation अध्ययन की सुविधा है । इस काम में, हम एक सतही प्रोटोकॉल का प्रदर्शन के लिए साइट का उत्पादन विशेष रूप से acetylated प्रोटीन मॉडल जीवाणु मेजबान के रूप में ई कोलाई का उपयोग करके । Malate डिहाइड्रोजनेज इस काम में एक प्रदर्शन उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया गया था ।

Introduction

प्रोटीन के बाद अनुवाद संशोधन (PTMs) अनुवाद प्रक्रिया के बाद होते हैं, और कार्यात्मक समूहों के एमिनो एसिड अवशेषों को आबंध अलावा से उठता है, लगभग सभी जैविक प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है, जीन सहित प्रतिलेखन, तनाव प्रतिक्रिया, सेलुलर भेदभाव, और चयापचय1,2,3। तिथि करने के लिए, के बारे में ४०० विशिष्ट PTMs की पहचान की गई है4। जीनोम और proteome के intricacy प्रोटीन PTMs द्वारा एक काफी हद तक परिलक्षित है, के रूप में वे प्रोटीन गतिविधि और स्थानीयकरण को विनियमित, और प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, लिपिड, और cofactors के रूप में अंय अणुओं के साथ बातचीत को प्रभावित5।

प्रोटीन acetylation पिछले दो दशकों6,7,8,9,10,11,12में PTMs अध्ययन में सबसे आगे रहा है । Lysine acetylation पहले histones में अधिक से अधिक ५० साल पहले की खोज की थी13,14, अच्छी तरह से छानबीन किया गया है, और अधिक से अधिक ८० प्रतिलेखन कारकों, नियामकों में अस्तित्व में जाना जाता है, और विभिंन प्रोटीन15, 16,17. प्रोटीन acetylation पर अध्ययन न केवल हमें अपने विनियामक तंत्र की गहरी समझ के साथ प्रदान की है, लेकिन यह भी बेकार acetylation की वजह से रोगों की एक संख्या के लिए निर्देशित उपचार18,19, 20 , 21 , 22 , 23. यह माना जाता था कि lysine acetylation केवल eukaryotes में होता है, लेकिन हाल के अध्ययनों से पता चला है कि प्रोटीन acetylation भी बैक्टीरियल फिजियोलॉजी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, chemotaxis सहित, एसिड प्रतिरोध, सक्रियण, और स्थिरीकरण pathogenicity आइलैंड्स और अन्य डाह संबंधित प्रोटीन्स24,25,26,27,28,29.

एक सामांय रूप से इस्तेमाल किया विधि जैव रासायनिक lysine acetylation विशेषताएं साइट का उपयोग कर रहा है-निर्देश mutagenesis । Glutamine अपने समान आकार और ध्रुवीयता की वजह से acetyllysine की नकल के रूप में प्रयोग किया जाता है । Arginine एक गैर acetylated lysine नकल के रूप में उपयोग किया जाता है, क्योंकि यह शारीरिक स्थितियों के तहत अपने सकारात्मक आरोप को बरकरार रखता है, लेकिन acetylated नहीं हो सकता । हालांकि, दोनों की नकल असली isosteres नहीं है और हमेशा की उंमीद परिणाम30उपज नहीं है । सबसे कठोर दृष्टिकोण विशिष्ट lysine अवशेषों पर homogeneously acetylated प्रोटीन उत्पन्न करना है, जो प्रकृति7,11में lysine acetylation के कम stoichiometry के कारण अधिकांश शास्त्रीय विधियों के लिए कठिन या असंभव है । इस चुनौती आनुवंशिक कोड विस्तार की रणनीति है, जो एक इंजीनियर pyrrolysyl-tRNA synthetase संस्करण Methanosarcinaceae प्रजातियों से tRNA के साथ Pylacetyllysine प्रभारी को रोजगार से सुलझाया गया है, मेजबान का उपयोग mRNA में UAG stop codon को दबाने के लिए शोधों मशीनरी, और लक्ष्य प्रोटीन की डिज़ाइन की गई स्थिति में acetyllysine का निगमन31का निर्देशन करता है । हाल ही में, हमने एक बेहतर EF-Tu-बाइंडिंग tRNA३२ और अपग्रेडेड acetyllysyl-tRNA synthetase३३के साथ इस सिस्टम को ऑप्टिमाइज़ किया है । इसके अलावा, हम malate डिहाइड्रोजनेज३४ और tyrosyl-tRNA synthetase३५के acetylation अध्ययन में इस बढ़ाया निगमन प्रणाली लागू किया है । इस के साथ साथ, हम malate डिहाइड्रोजनेज (MDH), जो हम बड़े पैमाने पर एक प्रदर्शन उदाहरण के रूप में अध्ययन किया है का उपयोग करके जैव रासायनिक पहचान के लिए आणविक क्लोनिंग से शुद्ध रूप से acetylated प्रोटीन पैदा करने के लिए प्रोटोकॉल का प्रदर्शन ।

Protocol

1. साइट-लक्ष्य जीन का निर्देशन Mutagenesis नोट: MDH T7 प्रमोटर के अंतर्गत व्यक्त की है केएमएफ-1 सदिश के साथ CloDF13 मूल और एक प्रति संख्या के साथ 20 में ४०३४। परिचय १४० स्थिति पर एंबर बंद codon प्र?…

Representative Results

acetylated MDH प्रोटीन की उपज 1 एल संस्कृति प्रति 15 मिलीग्राम था, जबकि जंगली प्रकार के MDH की थी 31 1 एल संस्कृति प्रति मिलीग्राम । शुद्ध प्रोटीन एसडीएस द्वारा विश्लेषण-पृष्ठ के रूप में चित्रा 1</stron…

Discussion

गैर विहित अमीनो एसिड के आनुवंशिक शामिल (ncaas) एक सौंपा codon के दमन पर आधारित है, ज्यादातर एंबर बंद codon UAG३६,३७,३८,३९, ncAA द्वारा आरोप लगाया tRNA जिसमें संगत anticodon । के रूप…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस कार्य को NIH (AI119813), Arkansas विश्वविद्यालय की और से पुरस्कार Arkansas को विज्ञान संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Bradford protein assay Bio-Rad 5000006 Protein concentration
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747 SDS sample buffer
Coomassie G-250 Stain Bio-Rad 1610786 SDS-PAGE gel staining
4-20% SDS-PAGE ready gel Bio-Rad 4561093 Protein determination
Ac-K-100 (HRP Conjugate) Cell Signaling 6952 Antibody
IPTG CHEM-IMPEX 194 Expression inducer
Nε-Acetyl-L-lysine CHEM-IMPEX 5364 Noncanonical amino acid
PD-10 desalting column GE Healthcare 17085101 Desalting
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit NEB E0554 Introducing the stop codon
BL21 (DE3) cells NEB C2527 Expressing strain
QIAprep Spin Miniprep Kit QIAGEN 27106 Extracting plasmids
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 Affinity purification resin
nicotinamide Sigma-Aldrich N3376 Deacetylase inhibitor
β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250 Reducing agent
BugBuster Protein Extraction Reagent Sigma-Aldrich 70584 Breaking cells
Benzonase nuclease Sigma-Aldrich E1014 DNase
ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher 32106 Chemiluminescence
Premixed LB Broth VWR 97064 Cell growth medium
Bovine serum albumin VWR 97061-416 western blots blocking
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References

  1. Krishna, R. G., Wold, F. Post-translational modification of proteins. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol. 67, 265-298 (1993).
  2. Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M. Deciphering post-translational modification codes. FEBS Lett. 587 (8), 1247-1257 (2013).
  3. Walsh, C. T. . Posttranslational modification of proteins : expanding nature’s inventory. , (2006).
  4. Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database. Sci Rep. 1, (2011).
  5. Grotenbreg, G., Ploegh, H. Chemical biology: dressed-up proteins. Nature. 446 (7139), 993-995 (2007).
  6. Arif, M., Selvi, B. R., Kundu, T. K. Lysine acetylation: the tale of a modification from transcription regulation to metabolism. Chembiochem. 11 (11), 1501-1504 (2010).
  7. Cohen, T., Yao, T. P. AcK-knowledge reversible acetylation. Science’s STKE : signal transduction knowledge environment. (245), pe42 (2004).
  8. Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).
  9. Escalante-Semerena, J. C. Nε-acetylation control conserved in all three life domains. Microbe. 5, 340-344 (2010).
  10. Kouzarides, T. Acetylation: a regulatory modification to rival phosphorylation?. The EMBO journal. 19 (6), 1176-1179 (2000).
  11. Soppa, J. Protein acetylation in archaea, bacteria, and eukaryotes. Archaea. , (2010).
  12. Verdin, E., Ott, M. 50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).
  13. Allfrey, V. G., Faulkner, R., Mirsky, A. E. Acetylation and Methylation of Histones and Their Possible Role in the Regulation of Rna Synthesis. P Natl Acad Sci USA. 51, 786-794 (1964).
  14. Phillips, D. M. The presence of acetyl groups of histones. Biochem j. 87, 258-263 (1963).
  15. Sterner, D. E., Berger, S. L. Acetylation of histones and transcription-related factors. Microbiology and molecular biology reviews: MMBR. 64 (2), 435-459 (2000).
  16. Glozak, M. A., Sengupta, N., Zhang, X., Seto, E. Acetylation and deacetylation of non-histone proteins. Gene. 363, 15-23 (2005).
  17. Close, P., et al. The emerging role of lysine acetylation of non-nuclear proteins. Cell Mol Life Sci. 67 (8), 1255-1264 (2010).
  18. Iyer, A., Fairlie, D. P., Brown, L. Lysine acetylation in obesity, diabetes and metabolic disease. Immunol Cell Biol. 90 (1), 39-46 (2012).
  19. You, L., Nie, J., Sun, W. J., Zheng, Z. Q., Yang, X. J. Lysine acetylation: enzymes, bromodomains and links to different diseases. Essays Biochem. 52, 1-12 (2012).
  20. Bonnaud, E. M., Suberbielle, E., Malnou, C. E. Histone acetylation in neuronal (dys)function. Biomol Concepts. 7 (2), 103-116 (2016).
  21. Fukushima, A., Lopaschuk, G. D. Acetylation control of cardiac fatty acid beta-oxidation and energy metabolism in obesity, diabetes, and heart failure. Biochim Biophys Acta. 1862 (12), 2211-2220 (2016).
  22. Kaypee, S., et al. Aberrant lysine acetylation in tumorigenesis: Implications in the development of therapeutics. Pharmacol Ther. 162, 98-119 (2016).
  23. Tapias, A., Wang, Z. Q. Lysine Acetylation and Deacetylation in Brain Development and Neuropathies. Genomics Proteomics Bioinformatics. 15 (1), 19-36 (2017).
  24. Hu, L. I., Lima, B. P., Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: the dawning of a new age. Molecular microbiology. 77 (1), 15-21 (2010).
  25. Jones, J. D., O’Connor, C. D. Protein acetylation in prokaryotes. Proteomics. 11 (15), 3012-3022 (2011).
  26. Bernal, V., et al. Regulation of bacterial physiology by lysine acetylation of proteins. New biotechnol. 31 (6), 586-595 (2014).
  27. Hentchel, K. L., Escalante-Semerena, J. C. Acylation of Biomolecules in Prokaryotes: a Widespread Strategy for the Control of Biological Function and Metabolic Stress. Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. 79 (3), 321-346 (2015).
  28. Ouidir, T., Kentache, T., Hardouin, J. Protein lysine acetylation in bacteria: Current state of the art. Proteomics. 16 (2), 301-309 (2016).
  29. Wolfe, A. J. Bacterial protein acetylation: new discoveries unanswered questions. Curr Genet. 62 (2), 335-341 (2016).
  30. Albaugh, B. N., Arnold, K. M., Lee, S., Denu, J. M. Autoacetylation of the histone acetyltransferase Rtt109. J Biol Chem. 286 (28), 24694-24701 (2011).
  31. Neumann, H., Peak-Chew, S. Y., Chin, J. W. Genetically encoding Nε-acetyllysine in recombinant proteins. Nat chem biol. 4 (4), 232-234 (2008).
  32. Fan, C., Xiong, H., Reynolds, N. M., Soll, D. Rationally evolving tRNAPyl for efficient incorporation of noncanonical amino acids. Nucleic Acids Res. 43 (22), e156 (2015).
  33. Bryson, D., et al. Continuous directed evolution of aminoacyl-tRNA synthetases to alter amino acid specificity and enhance activity. Nat Chem Biol. , (2017).
  34. Venkat, S., Gregory, C., Sturges, J., Gan, Q., Fan, C. Studying the Lysine Acetylation of Malate Dehydrogenase. J Mol Biol. 429 (9), 1396-1405 (2017).
  35. Venkat, S., Gregory, C., Gan, Q., Fan, C. Biochemical characterization of the lysine acetylation of tyrosyl-tRNA synthetase in Escherichia coli. Chembiochem. 18 (19), 1928-1934 (2017).
  36. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  37. Mukai, T., Lajoie, M. J., Englert, M., Soll, D. Rewriting the Genetic Code. Annu Rev Microbiol. , (2017).
  38. O’Donoghue, P., Ling, J., Wang, Y. S., Soll, D. Upgrading protein synthesis for synthetic biology. Nat Chem Biol. 9 (10), 594-598 (2013).
  39. Chin, J. W. Expanding and reprogramming the genetic code of cells and animals. Annu Rev Biochem. 83, 379-408 (2014).
  40. O’Donoghue, P., et al. Near-cognate suppression of amber, opal and quadruplet codons competes with aminoacyl-tRNAPyl for genetic code expansion. FEBS Lett. 586 (21), 3931-3937 (2012).
  41. Aerni, H. R., Shifman, M. A., Rogulina, S., O’Donoghue, P., Rinehart, J. Revealing the amino acid composition of proteins within an expanded genetic code. Nucleic Acids Res. 43 (2), e8 (2015).
  42. Huang, Y., et al. A convenient method for genetic incorporation of multiple noncanonical amino acids into one protein in Escherichia coli. Mol Biosyst. 6 (4), 683-686 (2010).
  43. Venkat, S., et al. Genetically encoding thioacetyl-lysine as a nondeacetylatable analog of lysine acetylation in Escherichia coli. FEBS Open. , (2017).
  44. Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool. Biochim Biophys Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).
  45. Gregoretti, I. V., Lee, Y. M., Goodson, H. V. Molecular evolution of the histone deacetylase family: functional implications of phylogenetic analysis. J Mol Biol. 338 (1), 17-31 (2004).
  46. Weinert, B. T., et al. Acetyl-phosphate is a critical determinant of lysine acetylation in E. coli. Mol cell. 51 (2), 265-272 (2013).

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Venkat, S., Gregory, C., Meng, K., Gan, Q., Fan, C. A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli. J. Vis. Exp. (130), e57061, doi:10.3791/57061 (2017).
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