Summary

特性と密度勾配遠心によるマウスのプライマリ ミクログリアの分離

Published: February 16, 2018
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Summary

マウスの脳からプライマリ ミクログリアの隔離のためのプロトコルが表示されます。この手法は、神経学的な条件の現在の理解の促進に役立ちます。密度勾配遠心法と磁気分離は、純度の高いサンプルの十分な収量を生成する結合されます。さらに、ミクログリアの特性評価のための手順をまとめました。

Abstract

ミクログリア、脳内の居住者の免疫細胞は、炎症や中枢神経系に傷害の最初の反応です。最近の研究は、動的、プロ炎症性と抗炎症の表現型を想定しての対応するミクログリアを明らかにしました。M1 (炎症) と M2 (pro 修復) 表現型プレイ アミロイド条件周産期の脳損傷など展示異なる重要な役割機能ある特定の環境刺激に応答します。ミクログリア活性化の変調は神経保護ミクログリアが脳損傷の治療の可能性あるかもしれませんが示唆を与えるに指摘されています。しかしより多くの研究は病気におけるミクログリアの役割を理解するために必要なこのプロトコルを容易にします。プロトコルは下記を組み合わせた磁気分離、体外実験のために使用できる主要な小グリア細胞の純度の高いサンプルの生産と細胞の残骸を減らすために密度勾配の遠心分離プロセス、2-3 週間培養の必要があります。さらに、評価手順は、ミクログリア、偏光の私達の理解を改善するための研究を支援し、これらの細胞のプライミング再生医療の分野で強力な影響を持っている情報の堅牢な機能を得られます。

Introduction

炎症、低酸素虚血および出血から周産期の期間中に取得した損傷は長期的後遺症の配列を持つことができます。周産期の脳損傷の複雑な病態は炎症や虚血後の神経細胞と軸索の死1理論します。生得の免疫反応は、傷害2につながるイベントの連鎖で重要な役割を果たしています。

ミクログリア、中枢神経系 (CNS)、内居住者の免疫細胞は、傷害3の最初の反応です。ミクログリアは、4の環境保護や毒性、依存する容量を持つプラスチック電池種類です。走化性、食作用、抗原提示、サイトカインや活性酸素種45の生産に関与しています。老齢ミクログリアは常に環境を調査し、外国または有害物質4の存在によってアクティブ化されます。活性化は、中枢神経系の保護4で重要な炎症応答に します。これらの M1「炎症」表現型ミクログリア主に抗原提示と病原体4の死に関与しています。にもかかわらず、神経保護の炎症反応の重要な役割は、自由なまたは長期の炎症が神経損傷4につながる有害なにできます。ただし、特定の環境の刺激にさらされると、ミクログリアは抗炎症の表現型を表わすことができます。これら pro 修復 M2 ミクログリア創傷治癒と修復6各種のサイトカインを放出する重要な役割があるし、他の溶性メディエーター レセプター炎症、貪食能を増加し、促進する修復4, 7. ミクログリアの役割は多様であり、再髄鞘化8、脳卒中モデル9で酸素とグルコース枯渇中に神経細胞を保護して神経突起を推進運転オリゴデンドロ サイト分化脊髄損傷は、10をモデル化します。

これらのグリア細胞の研究を理解および neuroinflammation への応答の処理で重要な側面を表します。記述のプロトコル アミロイド疾患におけるミクログリアの変調方式の治療の可能性をさらに調査できます。

ミクログリア活性化神経の役割への変調は、条件11,12,13の範囲で観察されています。したがって、現在の理解と活性化ミクログリアの変調をさらに勉強して改善は重要なin vitroin vivoの両方を含むさまざまなモデルの使用を必要とします。In vitroの研究より効率、低いコストと能力孤立セル人口を調査するための重要なツールを表します。

ミクログリア マウス脳から効率的に良い生存率および高純度と高収率のサンプルを生成する課題の分離のための文献に記載されているプロトコルの範囲があります。プライマリ ミクログリアの分離の一般的に使用される方法は、磁気分離と混合培養の揺れです。個人的な経験を通して、磁気の列を妨げ細胞の残骸の高度があったことが分られました。したがって、次のプロトコルは、CD11b 磁気分離に続いて初期密度勾配遠心法手順を組み込んだに利用されました。下記プロトコルは、十分な量の非常に純粋なサンプルを生成する最適化されています。その高純度と短い期間のために有利である-1 つは、2-3 週間培養することがなく 2 日以内の試金を実行できます。このプロトコルは、プライマリ マウスアストロの隔離のため潜在的適応ことができます。

Protocol

次の手順は、モナシュ大学の動物倫理委員会によって承認されています。代表的な結果を生成する健康的な未処理新生児 C57Bl6/J P3-6 マウスが使用されました。 1. 酵素の消化力 注: 不妊の分離及び初代培養細胞を培養するときを考慮する重要です。環境は可能な限り滅菌を確保しながら初期の郭清とマウス脳の収穫を亂流フード外完了して層流フード内…

Representative Results

ここで説明した方法を使用して、ミクログリアの純粋な人口は分離できるので、体外と FACS 解析を用いた特性評価のために準備することができます。そもそも、18 動物まで使用できます選別、約 450,000 600,000 ミクログリア細胞の期待利回りあたり。最初に単離細胞の純度を確認することが重要だし、CD45 と CD11b ミクログリアの同定、2 つのマーカーの染色で FACS …

Discussion

ミクログリアは、環境刺激によって変更両方 pro – と抗炎症、能力を持っています。前の研究は、ミクログリアの活性化の変調は神経保護を与えることができる示されています。ニューロンに保護を提供して損傷を修復する能力は、これらの複雑な細胞の現在の理解を促進するためのより多くの研究を必要とします。したがって、高純度プライマリ ミクログリアの分離は重要かつ有用な手法?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

DMEM, low glucose, pyruvate Gibco 11885084
Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco 15240062
DNaseI grade II from bovine pancreas Sigma-Aldrich 10104159001
Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution Sigma-Aldrich P3125-100mg
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated Gibco 16140071
Percoll GE Healthcare 17-0891-01
Hank's Balanced Salt Solution (1X) Gibco 14175-103
Hank's Balanced Salt Solution (10X) Gibco 14185052
EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit StemCell Technologies 18770 EasySep magnet variant
EasySep magnet StemCell Technologies 18000
EasySep Buffer StemCell Technologies 20144
Dulbecco's Phosphate buffered saline Gibco 14040182
Trypsin (2.5%) (10X) Gibco 15090-046
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) BD Biosciences 553141
Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile Corning 352063
175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap Corning 431080
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 Sigma-Aldrich L5024
96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom Corning CLS3799
Paraformaldehyde (powder, 95%) Sigma-Aldrich 158127
Triton-X Sigma-Aldrich X100
Rabbit Anti-Iba1 Wako 01919741 
Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam ab150077
FACS Antibodies Company Catalog Number
V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO BD Biosciences 560501
PerCP-Cy5.5 CD11b  eBiosciences 45-0112-82
ZombieNIR Biolegend 423105
pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate Thermo Fisher Scientific P35361
Annexin.V_FITC Miltenyi Biotech 130-093-060
Propodium Iodide solution Miltenyi Biotech 130-093-233

References

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Cite This Article
Stark, J. C., Wallace, E., Lim, R., Leaw, B. Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation. J. Vis. Exp. (132), e57065, doi:10.3791/57065 (2018).

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