लक्षण वर्णन और घनत्व ढाल केंद्रापसारक द्वारा माउस प्राथमिक Microglia के अलगाव
Summary
murine दिमाग से प्राथमिक microglia के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है । इस तकनीक मस्तिष्क संबंधी स्थितियों की वर्तमान समझ को आगे बढ़ाने में एड्स । घनत्व ढाल केंद्रापसारक और चुंबकीय जुदाई के लिए एक उच्च शुद्ध नमूना की पर्याप्त उपज का उत्पादन करने के लिए संयुक्त कर रहे हैं । इसके अलावा, हम microglia के लक्षण वर्णन के लिए कदम रूपरेखा ।
Abstract
Microglia, मस्तिष्क में निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में सूजन या चोट करने के लिए पहले प्रतिक्रिया कर रहे हैं । हाल के शोध से पता चला है microglia गतिशील हो, दोनों समर्थक भड़काऊ और विरोधी भड़काऊ phenotypes संभालने में सक्षम है । दोनों एम 1 (प्रो-भड़काऊ) और M2 (pro-प्रतिकारक) phenotypes प्रसवकालीन मस्तिष्क चोट जैसे neuroinflammatory शर्तों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और कुछ पर्यावरणीय उत्तेजनाओं के जवाब में भिन्न कार्यों प्रदर्शन. microglial सक्रियण के मॉडुलन neuroprotection इस प्रकार microglia सुझाव मस्तिष्क चोट में चिकित्सीय क्षमता हो सकता है प्रदान करने के लिए उल्लेख किया गया है । हालांकि, और अधिक अनुसंधान के लिए बेहतर रोग में microglia की भूमिका को समझने की आवश्यकता है, और इस प्रोटोकॉल की सुविधा है कि । नीचे वर्णित प्रोटोकॉल एक घनत्व ढाल केंद्रापसारक प्रक्रिया को जोड़ती है सेलुलर मलबे को कम करने के लिए, चुंबकीय जुदाई के साथ, प्राथमिक microglial कोशिकाओं है कि इन विट्रो प्रयोग में के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक अत्यधिक शुद्ध नमूना उत्पादन, बिना 2-3 सप्ताह संवर्धन के लिए की जरूरत है । इसके अतिरिक्त, लक्षणात्मक कदम microglia के बारे में मजबूत कार्यात्मक डेटा उपज, अध्ययन सहायता के ध्रुवीकरण और इन कोशिकाओं है, जो अपक्षयी दवा के क्षेत्र में मजबूत प्रभाव पड़ता है की हमारी समझ बेहतर है ।
Introduction
सूजन, hypoxic-ischaemia और रक्तस्त्राव से प्रसवकालीन अवधि के दौरान प्राप्त नुकसान दीर्घकालिक sequelae की एक सरणी हो सकता है । प्रसवकालीन मस्तिष्क चोट के जटिल pathophysiology है theorized सूजन और आगामी न्यूरॉन और axonal मौत के साथ ischemia शामिल करने के लिए1. सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की घटनाओं के झरना में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है2चोट करने के लिए अग्रणी ।
Microglia, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के भीतर निवासी प्रतिरक्षा कोशिकाओं,3चोट करने के लिए पहले प्रतिक्रिया करने वालों हैं । Microglia क्षमता के साथ प्लास्टिक सेल प्रकार के होते है दोनों सुरक्षा या विषाक्त, पर्यावरण पर निर्भर4। वे chemotaxis, phagocytosis, प्रतिजन प्रस्तुति और साइटोकिंस और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों में से4,5के उत्पादन में शामिल हैं । वृद्ध होनेवाला microglia लगातार पर्यावरण सर्वेक्षण और एक विदेशी या हानिकारक पदार्थ की उपस्थिति के द्वारा सक्रिय कर रहे हैं 4. सक्रियण एक समर्थक भड़काऊ प्रतिक्रिया करने के लिए, सीएनएस संरक्षण4में महत्वपूर्ण होता है । ये M1 “प्रो भड़काऊ” phenotype microglia मुख्य रूप से प्रतिजन प्रस्तुति और रोगज़नक़ों की मौत में शामिल है4। neuroprotection, अनियंत्रित या लंबे समय तक सूजन में भड़काऊ प्रतिक्रिया की महत्वपूर्ण भूमिका के बावजूद हानिकारक हो सकता है और4ंयूरॉन क्षति के लिए सीसा । हालांकि, जब कुछ पर्यावरणीय उत्तेजनाओं को उजागर, microglia एक विरोधी भड़काऊ phenotype प्रदर्शन कर सकते हैं । ये प्रो प्रतिकारक M2 microglia घाव भरने में एक महत्वपूर्ण भूमिका है और6की मरंमत, साइटोकिंस और अंय घुलनशील मध्यस्थों की एक श्रृंखला जारी है कि सूजन downregulate, phagocytosis वृद्धि और मरंमत4को बढ़ावा, 7. microglia की भूमिकाओं में विविध रहे है और पुनः के दौरान oligodendrocyte भेदभाव ड्राइविंग शामिल है8, ऑक्सीजन और स्ट्रोक मॉडल9 में ग्लूकोज की कमी के दौरान ंयूरॉंस की रक्षा और neurite में वृद्धि को बढ़ावा देने के रीढ़ की हड्डी की चोट मॉडल10।
इन glial कोशिकाओं के अध्ययन को समझने और neuroinflammation के जवाब में हेरफेर में एक महत्वपूर्ण पहलू का प्रतिनिधित्व करता है । वर्णित प्रोटोकॉल neuroinflammatory विकारों में microglia मॉडुलन की चिकित्सीय क्षमता में आगे की जांच के लिए अनुमति देता है ।
एक न्यूरोप्रोटेक्टिव भूमिका की दिशा में microglial सक्रियण के मॉडुलन11,12,13शर्तों की एक श्रेणी में देखा गया है । इस प्रकार, वर्तमान समझ में सुधार और आगे microglial सक्रियण के मॉडुलन का अध्ययन महत्वपूर्ण है, दोनों में इन विट्रो और vivo मेंसहित विभिन्न मॉडलों के उपयोग की आवश्यकता होती है. इन विट्रो अध्ययन एक महत्वपूर्ण उनके अधिक से अधिक दक्षता, कम लागत और एक अलग सेल जनसंख्या की जांच करने की क्षमता के कारण उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
वहां murine दिमाग से microglia के अलगाव के लिए साहित्य में वर्णित प्रोटोकॉल की एक श्रृंखला है, को कुशलतापूर्वक अच्छी व्यवहार्यता और उच्च शुद्धता के साथ एक उच्च उपज नमूना उत्पादन चुनौती है । आमतौर पर प्राथमिक microglia के अलगाव के तरीकों का इस्तेमाल चुंबकीय जुदाई से कर रहे है और मिश्रित glial संस्कृतियों के लंबे समय तक मिलाते । व्यक्तिगत अनुभव के माध्यम से यह पाया गया कि वहां सेलुलर मलबे की एक उच्च डिग्री है जो चुंबकीय कॉलम बाधित किया गया था । इस प्रकार, निंनलिखित प्रोटोकॉल, जो एक प्रारंभिक घनत्व ढाल केंद्रापसारक CD11b चुंबकीय जुदाई के बाद कदम शामिल उपयोग किया गया था । नीचे वर्णित प्रोटोकॉल के लिए पर्याप्त मात्रा में एक उच्च शुद्ध नमूना उत्पादन अनुकूलित किया गया है । यह अपनी उच्च शुद्धता और कम समय अवधि के कारण लाभप्रद है-एक 2 दिनों के भीतर परख प्रदर्शन कर सकते है 2-3 सप्ताह के लिए संस्कृति के बिना । इस प्रोटोकॉल संभावित प्राथमिक murine astrocytes के अलगाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia दोनों समर्थक और विरोधी भड़काऊ, पर्यावरण उत्तेजनाओं द्वारा बदल सकता है की क्षमता है । पिछले अध्ययनों से पता चला है microglia सक्रियण के मॉडुलन neuroprotection प्रदान कर सकते हैं. उनकी क्षमता ंयूरॉंस और मरंमत की चोट …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
References
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110 (2009).
- Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
- Uwe-Karsten, H., Helmut, K. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature Neuroscience. 10 (11), 1387 (2007).
- Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O’Banion, M. K. Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed. Journal of neuroinflammation. 11, 98 (2014).
- Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).
- Guohua, W., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864 (2013).
- Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2009).
- Veronique, E. M., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nature Neuroscience. 16 (9), 1211 (2013).
- Hu, X., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia. Stroke. 43 (11), 3063 (2012).
- Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435 (2009).
- Suzuki, T. Microglial α7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role. Journal of neuroscience research. 83, (2006).
- Bedi, S. S. Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury. Stem cells translational medicine. 2, (2013).
- Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection. Journal of neuroinflammation. 5, 14 (2008).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System. PLOS ONE. 11 (2), e0150290 (2016).
- Leaw, B., et al. Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury. Stem cell research & therapy. 8 (1), 46 (2017).
- Moujalled, D., et al. TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway. Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).
