Karakterisering og isolering av musen primære Microglia av tetthet gradert sentrifugering
Summary
En protokoll for isolering av primære microglia fra murine hjerner er presentert. Denne teknikken hjelpemidler i å fremme den nåværende forståelsen av nevrologiske lidelser. Tetthet gradert sentrifugering og magnetiske separasjon kombineres for å produsere nok kapasitet i en svært ren utvalg. Videre skissere vi trinnene for karakterisering av microglia.
Abstract
Microglia, bosatt immunceller i hjernen, er de første responders betennelse eller skader i sentralnervesystemet. Nyere forskning har avdekket microglia være dynamisk, innta både pro-inflammatoriske og anti-inflammatorisk fenotyper. Både M1 (pro-inflammatoriske) og M2 (pro-reparative) fenotyper spille en viktig rolle i neuroinflammatory forhold som perinatal hjerneskade, og viser ulike funksjoner som svar på visse miljømessige stimuli. Modulering av microglial aktivisering har vært nevnt for å konferere neuroprotection dermed antyder microglia kan ha terapeutisk potensialet i hjerneskade. Men mer forskning er nødvendig for å forstå rollen som microglia i sykdom, og denne protokollen Letter. Protokollen beskrevet nedenfor kombinerer en tetthet gradert sentrifugering prosess for å reduserer mobilnettet rusk, med magnetiske separasjon, produsere en svært ren prøve primære microglial celler som kan brukes i vitro eksperimentering, uten den behov for 2-3 uker dyrking. I tillegg gir karakterisering trinnene robust funksjonelle data om microglia, hjelpe studier for å bedre vår forståelse av polarisering og grunning av disse cellene, som har sterke implikasjoner innen regenerativ medisin.
Introduction
Skade ervervet i perinatalperioden fra betennelse, hypoxic-Ischemi og blødning kan ha en rekke langsiktige sekvele. I komplekse Patofysiologien ved perinatal hjerneskade er theorized for å involvere betennelse og ischemia med påfølgende neuronal og axonal død1. Medfødte immunforsvaret spiller en viktig rolle i kaskade av hendelser som førte til skade2.
Microglia, bosatt immunceller i sentralnervesystemet (CNS), er de første responders skade3. Microglia er plast celletyper kapasitet til å være både beskyttende eller giftig, avhengig av miljøet4. De er involvert i chemotaxis, fagocytose, antigen presentasjon og produksjon av cytokiner og reaktive oksygen arter4,5. Senescent microglia konstant undersøkelsen miljøet og aktiveres av tilstedeværelsen av en utenlandsk eller skadelige stoffet4. Aktivering fører til en pro-inflammatoriske respons, kritisk i CNS beskyttelse4. Disse M1 “pro-inflammatoriske” fenotypen microglia er hovedsakelig involvert i antigen presentasjon og død av patogener4. Til tross for avgjørende rollen inflammatorisk respons i neuroprotection, kan ukontrollert eller langvarig betennelse være skadelig og føre til neuronal skade4. Men når de utsettes for visse miljømessige stimuli, kan microglia vise en anti-inflammatorisk fenotypen. Disse pro-reparative M2 microglia har en avgjørende rolle i sårtilheling og reparere6, slippe en rekke cytokiner og andre løselig meglere at downregulate betennelse, øke fagocytose og fremme reparere4, 7. rollene til microglia er variert og inkluderer kjøring oligodendrocyte differensiering under re-myelination8, beskytte neurons under oksygen og glukose uttømming i slag modeller9 og fremme neurite utvekst i ryggmargsskade modeller10.
Studiet av disse gliacellene representerer et viktig aspekt i forståelse og manipulere svaret neuroinflammation. Beskrevet protokollen lar for videre etterforskning i terapeutisk potensialet av microglia moduleringshjul i neuroinflammatory lidelser.
Modulering av microglial aktivisering mot en neuroprotective rolle er observert i en rekke forhold11,12,13. Dermed er forbedre nåværende forståelse og videre studere modulering av microglial aktivisering kritisk, krever bruk av ulike modeller inkludert både i vitro og i vivo. In vitro studier representerer et viktig verktøy for deres større effektivitet, lavere kostnader og evne til å etterforske en isolert celle befolkningen.
Det finnes en rekke protokoller beskrevet i litteraturen for isolering av microglia fra murine hjernen, utfordringen å effektivt produserer en høy avkastning prøve med god levedyktighet og høy renhetsgrad. Brukte metodene for isolering av primære microglia er av magnetiske separasjon og langvarig risting av blandet glial kulturer. Gjennom personlig erfaring, ble det funnet at det var en høy grad av mobilnettet rusk som hindret magnetiske kolonnen. Dermed ble følgende protokollen benyttet, hvilke opptar en innledende tetthet gradert sentrifugering trinn etterfulgt av CD11b magnetisk separasjon. Protokollen beskrevet nedenfor har blitt optimalisert for å produsere en svært ren prøve i tilstrekkelig mengde. Det er en fordel på grunn av dens høy renhetsgrad og kort tidsperiode-en kan utføre analyser innen 2 dager uten å kultur for 2-3 uker. Denne protokollen kan potensielt tilpasses for isolering av primære murine astrocyttene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia har muligheten til å være både pro og anti-inflammatorisk, endret av miljøet stimuli. Tidligere studier har vist modulering av microglia aktivisering kan tildele neuroprotection. Deres evne til å beskytte nevroner og reparere skader nødvendiggjør mer forskning for å fremme den nåværende forståelsen av disse komplekse cellene. Dermed er isolering av høy renhetsgrad primære microglia en viktig og nyttig teknikk. Dette er en relativt rask metode å oppnå svært ren primære microglia klar for i v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| DMEM, low glucose, pyruvate | Gibco | 11885084 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Gibco | 15240062 | |
| DNaseI grade II from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution | Sigma-Aldrich | P3125-100mg | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Gibco | 16140071 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (1X) | Gibco | 14175-103 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (10X) | Gibco | 14185052 | |
| EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit | StemCell Technologies | 18770 | EasySep magnet variant |
| EasySep magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| EasySep Buffer | StemCell Technologies | 20144 | |
| Dulbecco's Phosphate buffered saline | Gibco | 14040182 | |
| Trypsin (2.5%) (10X) | Gibco | 15090-046 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block™) | BD Biosciences | 553141 | |
| Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile | Corning | 352063 | |
| 175cm² Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap | Corning | 431080 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 | Sigma-Aldrich | L5024 | |
| 96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom | Corning | CLS3799 | |
| Paraformaldehyde (powder, 95%) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Rabbit Anti-Iba1 | Wako | 01919741 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150077 | |
| FACS Antibodies | Company | Catalog Number | |
| V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO | BD Biosciences | 560501 | |
| PerCP-Cy5.5 CD11b | eBiosciences | 45-0112-82 | |
| ZombieNIR | Biolegend | 423105 | |
| pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate | Thermo Fisher Scientific | P35361 | |
| Annexin.V_FITC | Miltenyi Biotech | 130-093-060 | |
| Propodium Iodide solution | Miltenyi Biotech | 130-093-233 |
References
- Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report). Lancet Neurology. 8 (1), 110 (2009).
- Saliba, E., Henrot, A. Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage. Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).
- Uwe-Karsten, H., Helmut, K. Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nature Neuroscience. 10 (11), 1387 (2007).
- Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O’Banion, M. K. Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed. Journal of neuroinflammation. 11, 98 (2014).
- Michell-Robinson, M. A., et al. Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair. Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).
- Guohua, W., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (12), 1864 (2013).
- Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration. Brain. 132 (2), 288-295 (2009).
- Veronique, E. M., et al. M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination. Nature Neuroscience. 16 (9), 1211 (2013).
- Hu, X., et al. Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia. Stroke. 43 (11), 3063 (2012).
- Kigerl, K. A., et al. Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord. The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435 (2009).
- Suzuki, T. Microglial α7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role. Journal of neuroscience research. 83, (2006).
- Bedi, S. S. Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury. Stem cells translational medicine. 2, (2013).
- Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection. Journal of neuroinflammation. 5, 14 (2008).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System. PLOS ONE. 11 (2), e0150290 (2016).
- Leaw, B., et al. Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury. Stem cell research & therapy. 8 (1), 46 (2017).
- Moujalled, D., et al. TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway. Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).
