यहां हम चूहों में कार्डियक-विशिष्ट जीन हेरफेर के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । संज्ञाहरण के तहत, माउस दिल चौथे पसलियों के बीच अंतरिक्ष के माध्यम से बाह्य थे । बाद में, एडिनोवायरस एंकोडिंग विशिष्ट जीन मायोकार्डियम में एक सिरिंज के साथ इंजेक्शन, के द्वारा प्रोटीन अभिव्यक्ति माप द्वारा पीछा किया गया vivo इमेजिंग और पश्चिमी दाग विश्लेषण में ।
विशेष रूप से दिल में जीन हेरफेर हृदय रोग pathomechanisms और उनकी चिकित्सीय क्षमता की जांच शक्ति प्रदान काफी है । vivo में कार्डिएक-विशिष्ट जीन डिलीवरी सामांयतः या तो प्रणालीगत या स्थानीय वितरण द्वारा प्राप्त की है । पूंछ नस के माध्यम से प्रणालीगत इंजेक्शन रिकॉमबिनेंट adeno-एसोसिएटेड वायरस 9 (AAV9) का उपयोग करके हृदय जीन अभिव्यक्ति जोड़ तोड़ में आसान और कुशल है । हालांकि, इस विधि के कुशल transduction के लिए वेक्टर के एक अपेक्षाकृत उच्च राशि की आवश्यकता है, और untargeted अंग जीन transduction में परिणाम हो सकता है । यहाँ, हम एक सरल, कुशल, और चूहों में vivo कार्डिएक-विशिष्ट जीन हेरफेर में के लिए intramyocardial इंजेक्शन की समय बचाने की विधि का वर्णन. संज्ञाहरण के तहत (वेंटिलेशन के बिना), कवच प्रमुख और छोटे मांसपेशियों को कुंद में विच्छेदित किया गया, और माउस दिल जल्दी से मैनुअल externalization द्वारा चौथे पसलियों के बीच अंतरिक्ष में एक छोटा सा चीरा के माध्यम से उजागर किया गया था । बाद में, एडीनोवायरस एंकोडिंग luciferase (ल्यूक) और विटामिन डी रिसेप्टर (VDR), या लघु hairpin आरएनए (shRNA) लक्ष्यीकरण VDR, मायोकार्डियम में एक हैमिल्टन सिरिंज के साथ इंजेक्ट किया गया था । बाद में vivo इमेजिंग कि luciferase सफलतापूर्वक दिल में विशेष रूप से व्यक्त किया गया था प्रदर्शित । इसके अलावा, पश्चिमी दाग विश्लेषण सफल व्यक्त या माउस दिल में VDR के मुंह बंद करने की पुष्टि की । एक बार महारत हासिल, इस तकनीक जीन हेरफेर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही कोशिकाओं या माउस दिल में nanogels के रूप में अंय सामग्री के इंजेक्शन ।
हृदय रोग रुग्णता और मृत्यु दुनिया भर में1,2का प्रमुख कारण है । रोधगलन और हृदय की विफलता सहित जीवन की धमकी दिल की स्थिति के लिए प्रभावी चिकित्सीय रणनीतियों की कमी अंतर्निहित pathomechanisms और उपंयास चिकित्सीय विकल्प3की पहचान के गहन अन्वेषण को आकर्षित करती है । इन वैज्ञानिक अन्वेषणों के लिए, कार्डियक-विशिष्ट जीन हेरफेर व्यापक रूप से4,5प्रयोग किया जाता है । कार्डिएक जीन हेरफेर जीनोम संपादन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है शक्तिशाली प्रतिलेखन उत्प्रेरक का उपयोग कर प्रभाव nuclease (तलेन) और नियमित रूप से प्रतिस्थानीय लघु palindromic (CRISPR)/CRISPR जुड़े प्रोटीन 9 (Cas9) उपकरण, या द्वारा संकुल की तरह अस्थानिक आनुवंशिक सामग्री की डिलिवरी (उदा, वायरस वैक्टर ले जाने जीन ब्याज की एंकोडिंग प्रोटीन)6। हालांकि जीनोम संपादन चूहों में रहने वाले सटीक और spatiotemporal जीनोम संशोधनों की अनुमति देता है, यह अभी भी एक समय लेने वाली और श्रम गहन अभ्यास है6। वैकल्पिक रूप से, हृदय-वायरस वेक्टर या छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना) जटिल प्रसव द्वारा विशेष जीन हेरफेर नियमित रूप से6प्रदर्शन कर रहे हैं ।
वायरस वेक्टर डिलीवरी वयस्क माउस दिल मोटे तौर पर दो रणनीतियों: प्रणालीगत या स्थानीय इंजेक्शन द्वारा हासिल की है । AAV9 के रूप में AAVs के cardiotropic सीरोटाइप के प्रणालीगत इंजेक्शन कार्डियक विशिष्ट जीन हेरफेर7के लिए आक्रामक है । हालांकि, इस विधि के एक अपेक्षाकृत उच्च राशि की आवश्यकता है वेक्टर कुशल transduction और जीन अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक है, और इस तरह की मांसपेशी और जिगर7के रूप में लक्षित अंगों की महत्वपूर्ण transduction में परिणाम हो सकता है । लोकल वायरस इंजेक्शन intramyocardial इंजेक्शन या intracoronary डिलिवरी7द्वारा हासिल की है । Intracoronary डिलीवरी intramyocardial इंजेक्शन की तुलना में दिल के भीतर वायरस का एक और भी वितरण करने के लिए सुराग । हालांकि, इस तकनीक का नुकसान प्रणालीगत संचलन और transduction के लिए untargeted अंगों में तेजी से वायरल वैक्टर से बाहर धोने रहे हैं8, और आपरेशन के दौरान दबाव माप के लिए उपकरणों की अपनी आवश्यकता । इसके विपरीत, intramyocardial इंजेक्शन मायोकार्डियम में बेहतर वायरस प्रतिधारण सक्षम बनाता है और साथ ही साइट विशिष्ट वितरण, लेकिन यह समान रूप से वायरल वेक्टर7वितरित करने के लिए विफल रहता है. छोटे जानवरों के लिए, intracoronary प्रसव के लिए तकनीकी रूप से कठिन प्रदर्शन है, जबकि प्रणालीगत AAV9 इंजेक्शन और intramyocardial इंजेक्शन अधिक सामांयतः4,5,7अभ्यास कर रहे हैं । हालांकि प्रणालीगत इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए आसान है, पारंपरिक intramyocardial इंजेक्शन यांत्रिक वेंटिलेशन और thoracotomy की आवश्यकता है, व्यापक ऊतक क्षति का कारण बनता है, और समय लेने वाली है ।
इस रिपोर्ट में, हम intramyocardial इंजेक्शन के लिए एक आसान, समय की बचत, और अत्यधिक कुशल विधि वर्णित है । एडीनोवायरस एंकोडिंग luciferase और VDR, या shRNA लक्ष्यीकरण VDR, हृदय जीन अभिव्यक्ति में हेरफेर इंजेक्शन था । एक बार महारत हासिल, इस विधि जीन हेरफेर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही कोशिकाओं या माउस दिल में अंय सामग्री के इंजेक्शन ।
वर्तमान रिपोर्ट हृदय जीन हेरफेर के लिए वायरल वैक्टर के intramyocardial इंजेक्शन के लिए एक संशोधित तकनीक को दर्शाता है, जो एक विधि से गाओ एट अल द्वारा रोधगलन प्रेरण के लिए संशोधित किया गया था । 13 वर्तम?…
The authors have nothing to disclose.
यह काम राष्ट्रीय विज्ञान कोष के प्रतिष्ठित युवा विद्वानों (८१६२५००२), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (८१४७०३८९, ८१२७०२८२, ८१६०१२३८), शंघाई अकादमिक अनुसंधान नेता (18XD1402400), शंघाई नगर निगम के कार्यक्रम के लिए समर्थन किया गया शिक्षा आयोग Gaofeng क्लिनिकल मेडिसिन ग्रांट सहायता (२०१५२२०९), शंघाई Shenkang हॉस्पिटल डेवलपमेंट सेंटर (16CR3034A), शंघाई Jiao टोंग यूनिवर्सिटी (YG2013MS42), शंघाई Jiao टोंग यूनिवर्सिटी स्कूल ऑफ मेडिसिन (15ZH1003 और 14XJ10019), शंघाई नौकायन कार्यक्रम (18YF1413000), और Bengbu मेडिकल कॉलेज (Byycx1722) के स्नातकोत्तर नवाचार कार्यक्रम । हम अपनी प्रयोगशाला में अपनी पिछली मदद के लिए Dr. Erhe गाओ धंयवाद ।
Equipments | |||
Laminar flow sterile hood | Fengshi Animal Experimental Equipment Techonology Co., Ltd. (Soochow, China) | FS-CJ-2F | |
Centrifuge | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 75005282 | |
Tissue grinding machine | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Scientz-48 | |
High temperature/high pressure sterilizer | Hirayama (Saitama, Japan) | HVE-50 | |
Isoflurane vaporizer | Matrix (Orchard Park, USA) | VIP3000 | |
IVIS Lumina III imaging system | PerkinElmer (Waltham, USA) | CLS136334 | |
Precision balance | Sartorius (Göttingen, Germany) | 28091873 | |
Instruments | |||
Eppendorf pipette (100 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000059 | |
Eppendorf pipette (10 µL) | Eppendorf (Westbury, USA) | 4920000113 | |
Forceps | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | JD4020 | Curved tip |
Hamilton syringe | Hamilton (Nevada, USA) | 80501 | Volume 50 μL |
Micro-mosquito hemostat | F.S.T (Foster City, USA) | 13011-12 | Curved, tip width 1.3mm |
Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | J32110 | |
Surgical scissors | F.S.T (Foster City, USA) | 14002-12 | |
1-mL Syringe | WeiGao Group Medical Polymer Co.,Ltd. (ShangDong, China) | ||
Materials and reagents | |||
Anti-GAPDH antibody | CST (Danvers, USA) | #2118 | |
Anti-Luciferase antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab187340 | |
Anti-rabbit IgG | CST (Danvers, USA) | #7074 | |
Anti-VDR antibody | Abcam (Cambridge, UK) | ab109234 | |
Buprenorphine | Thermo Scientific (Waltham, USA) | PA175056 | |
Chloralic hydras | LingFeng Chemical (ShangHai, China) | ||
Cryogenic Vials | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 375418 | 1.8 mL |
Depilatory cream | Veet (Shanghai, China) | ||
Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco (Grand Island, USA) | 14040133 | |
Entoiodine | LiKang (Shanghai, China) | 310132 | |
EP tube | Sarstedt (Newton, USA) | PCR001 | |
Filter | Millipore (Bedford, USA) | Pore size 0.2 µm | |
Isoflurane | Yipin Pharmaceutical Company (Hebei, China) | ||
Luciferin | Promega (Madison, USA) | P1041 | |
Lysis buffer for western blot | Beyotime (Shanghai, China) | P0013J | Without inhibitors |
Ophthalmic cream | Apex Laboratories ( Melbourne, Australia)) | ||
PBS | Gibco (Grand Island, USA) | 10010023 | |
Protease inhibitor cocktail | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 78438 | |
5-0 silk suture | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. (Shanghai, China) | ||
Steel ball | Scientz Biotechnology Co., Ltd. (Ningbo, China) | Width 1.5 mm | |
Syringe needle | Kindly Medical Devices Co., Ltd. (Zhejiang, China) | 30 gauge | |
Warm mat | Warmtact Electrical Heating Technology Co., Ltd. (Guangdong, China ) | NF-GNCW |