Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Histone endringer fra Saccharomyces cerevisiae
Summary
Her beskriver vi en protokoll for chromatin immunoprecipitation av modifisert histones fra spirende gjær Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecipitated DNA blir brukt i kvantitative PCR avhøre overflod og lokalisering av histone post-translasjonell endringer i genomet.
Abstract
Histone post-translasjonell endringer (PTMs), som acetylation, metylering og fosforylering, reguleres dynamisk av en rekke enzymer som legge til eller fjerne disse merkene svar på signaler mottatt av cellen. Disse PTMS er viktige bidragsytere til regulering av prosesser som gene expression kontroll DNA-reparasjon. Chromatin immunoprecipitation (chIP) har vært medvirkende tilnærming for dissekere overflod og lokalisering av mange histone PTMs gjennom genomet svar på ulike forstyrrelser til cellen. Her, er en allsidig metode for å utføre chIP av post-translationally endret histones fra spirende gjær Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) beskrevet. Denne metoden er avhengig av crosslinking proteiner og DNA med formaldehyd behandling av gjær kulturer, generasjon av gjær lysates av perle slo, solubilization av chromatin av micrococcal nuclease og immunoprecipitation av histone-DNA komplekser. DNA tilknyttet histone merket av interesse er renset og utsatt for kvantitative PCR-analyse for å vurdere en berikelse på flere loci gjennom genomet. Representant eksperimenter sondering lokalisering av histone merkene H3K4me2 og H4K16ac i wildtype og mutant gjær diskuteres for å demonstrere dataanalyse og tolkning. Denne metoden er egnet for en rekke histone PTMs og kan utføres med ulike mutant stammer eller i nærvær av ulike miljømessige påkjenninger, noe som gjør det til et utmerket verktøy for å undersøke endringer i chromatin dynamics under ulike forhold.
Introduction
Den dynamiske post-translasjonell modifikasjonen (PTM) av histones er en viktige forskrifter mekanisme for mange DNA mal prosesser, inkludert transkripsjon, replikering og DNA reparasjon1,2. Muligheten til å bestemme overflod og nøyaktig lokalisering av modifisert histones samtidig med disse prosessene er derfor avgjørende for å forstå deres regulering under ulike forhold i cellen. Utviklingen av chromatin immunoprecipitation (chIP) som i stor grad stammet fra biokjemiske studiene av vekselvirkningene proteiner med DNA, spesielt i vitro metoder ved hjelp av kjemiske crosslinkers, sammen med behovet for å evaluere den dynamikken av protein-DNA interaksjoner i vivo og i bestemte områder av genomet3,4,5. Fremme av kvantitative PCR (qPCR) og sekvensering teknologi har også utvidet utføre chIP eksperimenter med kvantitative sammenligninger og over hele genomer, noe som gjør det til et kraftig verktøy for dissekere DNA-protein interaksjoner i flere nivåer.
Foreløpig er chIP en nødvendig metode for noen forskningsgruppe interessert i chromatin-mediert regulering av genomet som det er ingen sammenlignbare metoder for direkte avhør fysiske koblingen mellom en modifisert histone og et bestemt genomisk locus i vivo. Selv om det finnes varianter av denne metoden med neste generasjons sekvensering for å kartlegge histone endringer i genomet6,7 , kan disse ta forskjellige vitenskapelige spørsmål og deres skala, kostnader og tekniske ressurser kan begrense for noen forskningsgrupper. I tillegg målrettet chIP-qPCR er nødvendig for å utfylle disse tilnærminger ved å tilby metoder både optimalisere chIP protokollen før sekvensering og validere resultatene fra epigenomic datasett. Massespektrometri basert tilnærminger for identifisere komplette histone merker tilknyttet genomisk regioner har også dukket opp8,9,10,11, men dette metodene har noen begrensninger om hvilke deler av genomet kan bli analysert og krever teknisk ekspertise og instrumentering som ikke vil være tilgjengelige for alle forskning. Derfor fortsatt chIP en grunnleggende metode for å analysere overflod og distribusjon av histone endringer under ulike forhold for alle forskningsgrupper interessert i epigenetics, chromatin og regulering av genomisk funksjoner.
Her beskriver vi en metode for chIP bruker spirende gjær modell Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) for å undersøke fordelingen av histone PTMs på chromatin. Denne tilnærmingen er avhengig av en rekke kjernekomponenter chIP protokoller utviklet i gjær og brukes også i ulike modell systemer12,13. Interaksjoner mellom modifisert histones og DNA i cellen beholdes av crosslinking med formaldehyd. Etter lysate forberedelse, chromatin fragmenter er solubilized til enhetlig størrelse fragmenter av fordøyelse med micrococcal nuclease. Immunoprecipitation av de endrede histones utføres med enten kommersielle eller lab-generert antistoffer og alle tilknyttede DNA er isolert og analysert for berikelse ved bestemte genomisk regioner ved hjelp av qPCR (figur 1). For mange histone modifikasjoner er antallet av DNA fra denne protokollen tilstrekkelig for testing mer enn 25 forskjellige genomisk loci av qPCR.
Denne brikken metoden er allsidige overvåking distribusjon av en enkelt histone endring i flere mutant stammer eller miljøforhold eller teste flere histone endringer i wildtype celler på en rekke genomisk loci. Videre er mange komponenter av protokollen lett justerbar å optimalisere påvisning av enten svært – eller ydmyk-rikelig histone merker. Til slutt gir utfører chIP av modifisert histones i spirende gjær muligheten til å bruke nøkkelen kontrollerer for antistoff spesifisitet stort sett utilgjengelige på andre systemer. Nemlig, gjær påkjenningen kan genereres som bærer punkt mutasjoner i histone rester som er målrettet for endring, og i noen tilfeller er det bare et enkelt enzym som gir endring på en bestemt histone rester (f.eks. histone lysin methyltransferases). Derfor kan chIP utføres i enten histone mutant eller enzymsystemer sletting stammene til analysen som uspesifisert binding av antistoffer kan være oppstår og generere falske positive resultater. Denne kontrollen er spesielt verdifull for nyutviklet antistoffer, og kan også brukes til å validere antistoff spesifisitet for bevarte histone endringer før deres bruk i andre systemer. Dette utfyller andre metoder for å teste antistoff spesifisitet som skille mellom forskjellige endring stater (som mono – di- og tri-metylering), inkludert undersøkelser matriser av endrede peptider og utføre vestlige blots av histones eller nucleosomes definerte modifikasjoner. Samlet er chIP i spirende gjær en kraftfull metode for å vurdere dynamikken av histone PTMs gjennom genomet og dissekere mekanismene som styrer deres regulering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fremgangsmåten som er beskrevet her gir effektiv utvinning av DNA tilknyttet modifisert histones i gjærceller ved immunoprecipitation. Dette etterfølges av qPCR bruker primer som forsterke regioner av interesse å finne lokale berikelse eller uttømming av bestemte histone modifikasjoner. Til tross for utviklet som nesten 20 år siden, fortsatt chIP avgjørende analysen for å undersøke histone endringsstatusen genomisk regioner og under ulike forhold. Selv om chIP koblet til neste generasjons sekvensering teknologi …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gjerne takke medlemmer av den grønne lab for nyttig diskusjoner. Dette arbeidet var støttes delvis av NIH gir R03AG052018 og R01GM124342 til E.M.G.
Materials
| Yeast Extract | Research Products International (RPI) | Y20025-1000.0 | |
| Peptone | Research Products International (RPI) | P20250-1000.0 | |
| Dextrose | ThermoScientific | BP350-1 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| Glycine | Fisher Scientific | AC12007-0050 | |
| Tris | Amresco | 0497-5KG | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758-500G | |
| NaCl | ThermoScientific | BP358-10 | |
| 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | 74385 | Equivalent to NP-40 |
| MgCl | ThermoScientific | S25533 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 20899-25G-F | |
| LiCl | ThermoScientific | AC413271000 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Amresco | M107-1KG | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970-100G | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| NaHCO3 | ThermoScientific | S25533 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626-5G | |
| Yeast protease inhibitor cocktail | VWR | 10190-076 | |
| 25 Phenol:24 Chloroform:1 Isoamyl Alcohol | VWR Life Science | 97064-824 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Nuclease-Free Water | VWR | 100720-992 | |
| Micrococcal Nuclease | Worthington Biochemical | LS004797 | |
| Glycogen | ThermoScientific | R0561 | |
| Proteinase K | Research Products International (RPI) | P50220-0.1 | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R6513-50MG | |
| Bradford Assay Reagent | ThermoScientific | 23238 | |
| BSA Standard 2 mg/mL | ThermoScientific | 23210 | |
| α H4 | EMD Millipore | 04-858 | |
| α H4K16ac | EMD Millipore | ABE532 | |
| α H3 | Abcam | ab1791 | |
| α H3K4me2 | Active Motif | 39142 | |
| High Rox qPCR Mix | Accuris qMax Green, Low Rox qPCR Mix | ACC-PR2000-L-1000 | |
| Protein A/G Magnetic Beads | ThermoScientific | 88803 | |
| magnetic stand for 1.5mL tubes | Fisher Scientific | PI-21359 | |
| Acid-Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | |
| Microtube Homogenizer | Benchmark | D1030 | |
| 2.0 mL screw-cap tubes with sealing rings | Sigma-Aldrich | Z763837-1000EA | |
| Gel loading tips | Fisher Scientific | 07-200-288 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific | 50-476-476 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-10 | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| 384-Well PCR Plate | Fisher Scientific | AB-1384W | |
| Gyratory Floor Shaker | New Brunswick Scientific | Model G10 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | ND-2000c | |
| Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | 1855485 |
References
- Jaiswal, D., Turniansky, R., Green, E. M. Choose Your Own Adventure: The Role of Histone Modifications in Yeast Cell Fate. J Mol Biol. 429 (13), 1946-1957 (2017).
- Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and combinatorial functions of histone modifications. Annu Rev Biochem. 80, 473-499 (2011).
- Solomon, M. J., Varshavsky, A. Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures. P Natl Acad Sci USA. 82 (19), 6470-6474 (1985).
- Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 53 (6), 937-947 (1988).
- Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. P Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
- Lefrançois, P., et al. Efficient yeast ChIP-Seq using multiplex short-read DNA sequencing. BMC Genomics. 10, 37 (2009).
- Furey, T. S. ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions. Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).
- Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic Loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
- Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. J. ChAP-MS: a method for identification of proteins and histone posttranslational modifications at a single genomic locus. Cell Rep. 2 (1), 198-205 (2012).
- Soldi, M., Bremang, M., Bonaldi, T. Biochemical systems approaches for the analysis of histone modification readout. Biochim Biophys Acta. 1839 (8), 657-668 (2014).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
- Kuo, M. H., Allis, C. D. In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment. Methods. 19 (3), 425-433 (1999).
- Meluh, P. B., Broach, J. R. Immunological analysis of yeast chromatin. Methods Enzymol. 304, 414-430 (1999).
- Rozen, S., Skaletsky, H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. Methods Mol Biol. 132, 365-386 (2000).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), S1-S5 (2010).
- Rodríguez, A., Rodríguez, M., Córdoba, J. J., Andrade, M. J. Design of primers and probes for quantitative real-time PCR methods. Methods Mol Biol. 1275, 31-56 (2015).
- Briggs, S. D., et al. Histone H3 lysine 4 methylation is mediated by Set1 and required for cell growth and rDNA silencing in Saccharomyces cerevisiae. Gene Dev. 15 (24), 3286-3295 (2001).
- Bernstein, B. E., et al. Methylation of histone H3 Lys 4 in coding regions of active genes. P Natl Acad Sci USA. 99 (13), 8695-8700 (2002).
- Pokholok, D. K., et al. Genome-wide map of nucleosome acetylation and methylation in yeast. Cell. 122 (4), 517-527 (2005).
- Krogan, N. J., et al. The Paf1 complex is required for histone H3 methylation by COMPASS and Dot1p: linking transcriptional elongation to histone methylation. Mol Cell. 11 (3), 721-729 (2003).
- South, P. F., Harmeyer, K. M., Serratore, N. D., Briggs, S. D. H3K4 methyltransferase Set1 is involved in maintenance of ergosterol homeostasis and resistance to Brefeldin A. P Natl Acad Sci USA. 110 (11), E1016-E1025 (2013).
- Margaritis, T., et al. Two distinct repressive mechanisms for histone 3 lysine 4 methylation through promoting 3′-end antisense transcription. PLoS Genet. 8 (9), e1002952 (2012).
- Jezek, M., et al. The histone methyltransferases Set5 and Set1 have overlapping functions in gene silencing and telomere maintenance. Epigenetics. 12 (2), 93-104 (2017).
- Suka, N., Luo, K., Grunstein, M. Sir2p and Sas2p opposingly regulate acetylation of yeast histone H4 lysine16 and spreading of heterochromatin. Nat Genet. 32 (3), 378-383 (2002).
- Kimura, A., Umehara, T., Horikoshi, M. Chromosomal gradient of histone acetylation established by Sas2p and Sir2p functions as a shield against gene silencing. Nat Genet. 32 (3), 370-377 (2002).
- Rothbart, S. B., et al. An Interactive Database for the Assessment of Histone Antibody Specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
