תלת מימדי עיבוד וניתוח של Immunolabeled, מובהר היפרדות villous חלקית וסקולרית הרשתות האנושיות
Summary
מחקר זה מציג עבור הרקמה הפיך ניקוי, immunostaining, תלת-ממד עיבוד וניתוח רשתות כלי דם השליה האנושית הדגימות villi גודל 1-2 מ מ3פרוטוקול.
Abstract
חילופי מזין וגז בין האם והעובר מתרחשת הממשק בדם intervillous אמהית, רשת נרחבת נימי villous חלקית המרכיבה הרבה parenchyma של השליה האנושית. הרשת נימי villous חלקית דיסטלי נמצאת התחנה הסופית של אספקת הדם העוברי לאחר מספר דורות של הסתעפות של כלי המשתרעת החוצה חבל הטבור. רשת זו יש נדן הסלולר רציפים, השכבה מכשול syncytial trophoblast, אשר מונע את ערבוב של דם עוברי והדם אימהי שבו זה ללא הרף הוא טובל. עלבונות לשלמותו של הרשת נימי היפרדות, המתרחשים הפרעות כגון סכרת אימהית, יתר לחץ דם, השמנת יתר, יש השלכות את הסיכונים הבריאותיים רציני הנוכחי של העובר, התינוק, למבוגרים. כדי להגדיר טוב יותר את השפעות מבניות העלבונות הללו, פרוטוקול פותחה עבור מחקר זה הלוכד את מבנה הרשת נימי גודל 1-2 מ מ3 שבו אחד יכול לחקור את מאפייניה טופולוגי המורכבות שלה מלא. כדי לעשות זאת, גזור אשכולות של מסוף villi מן השליה, בשכבה trophoblast, את endothelia נימי immunolabeled. אלה דוגמאות לאשורן ואז עם טישו חדש ניקוי תהליך אשר מאפשר רכישת אוספי תמונות קונאפוקלית z-לעומק של ~ 1 מ מ. הדמיות תלת מימדי מערימות אלה ואז מעובדים ניתח ליצירת אמצעי רשת נימי בסיסיים כגון נפח, מספר סניפים נימי, ואת ענף נימי נקודות קצה, כמו אימות של ההתאמה של גישה זו עבור אפיון רשת הנימים.
Introduction
הבנתנו את השליה המתפתח, פתולוגיות שלה, במידה רבה, מוגבל כדי להסיק יחסים מרחביים בין villi סמוכים נימים כלולות נגזר ממקטעים היסטולוגית. במחקר זה, פתרנו בעיה זו על-ידי פיתוח אמצעי כדי ליצור הדמיות תלת מימדי (3D) של רשתות נימי היפרדות האנושי המתאימים ניתוחים של תכונות רשת נימי (למשל הסתעפות, אחידות). לעשות את זה שילבנו מכתים immunofluorescent עם שני המוצרים ניקוי רקמות מסחרי, Visikol-1 ו- Visikol-2 (המכונים להלן פתרון-1 ופתרון-2).
השליה האנושית הוא מתחם עצום של כלי הדם הממוקם בין הדם intervillous של האם ואת העובר המתפתח. הרחבת החוצה מן ההכנסה שלה המשקולת שליה, הטבור סניפים לרשת של העורקים והוורידים אשר ramify כדי לכסות את המשטח שליה עם רשת כלי הדם משוכלל. הקצוות שלהם ואז לחדור למטה לתוך הפנים או עומק של הדיסק היפרדות איפה הם עוברים מספר דורות יותר מסעף ולסיים את villi מסוף, רשתות נימי כלולות, האתר של חילופי גזים, חומרים מזינים, וחילוף פסולת בין הדם העוברי, אימהית.
עלבונות לרשת הנימים היפרדות במהלך הפיתוח להיות השלכות מתמשך על הבריאות של העובר, הרך הנולד ו-2,למבוגרים מתהווים 1,3. על רקע ההריון הקשורות פתולוגיות כגון הפלה, הגבלת גדילה תוך רחמי, סוכרת רעלת היריון אימהי 4,5,6 שם הוא ערך גבוה על פיתוח שיטות מדידה, אפיון של היפרדות רשתות נימי villous חלקית. מחסום הגדולות היא היפרדות רשתות כלי דם להקיף מגוון רחב של קנה מידה. הרשתות וסקולרית משטח יכול להיות גדול כמו 4-5 מ מ קוטר. הנימים villous חלקית מסוף הם גודל 10-20 מיקרומטר בקוטר; השליה מכילה יותר מ 300 ק מ של כלי הדם 7. כיום, ישנן מספר טכניקות קל לשימוש, מהיר ומדויק יכול ללכוד אלה הקצוות של הסקאלה כלי. עד כה, רק מספר קטן של villi שיכול להתבצע על ידי מיקרוסקופ. לדוגמה, Jirkovska. et al. התמקדו סיסי היפרדות-מונח, שילוב מיקרוסקופיה קונפוקלית עם טורי מקטעים אופטי במרווחים 1 מיקרומטר, המתקבל 120 חלקים עבה של מיקרומטר; אין נתונים על מספר דוגמאות למד ולא סטטיסטיקה נמסרו 8. מבנים נימי אותרו, קווי המתאר של villi של נימים היו מצוירת ביד, עם לשרטוטים מיוצא לניתוח תמונה. בעוד המחברים לדון על ההשלכות של הממצאים שלהם עבור “גדל villous חלקית וסקולרית הרשת”, מסקנות כאלה הם בעייתיים כאשר רק “המונח” (36 + שבוע הריון גיל) הרקמה הוא למד. באופן דומה, מאיו ואחל’, פירס. ואח הסתמכה על הרקמה של אותו הגיל, עבור שלהם סימולציות של העברת זרימה וחמצן דם, אבל את בדיקותיהם היו מוגבלים רק כמה המונח, 9,villi מסוף10 . Stereology גם הוחל במחקר של המבנה של כלי villous חלקית. אבל שוב, המוקד כבר בדרך כלל על הריונות מאוחר יותר אספקת liveborn תינוקות עם אחד או יותר ההריון סיבוכים 11,12.
עד לאחרונה, מיקרוסקופיה קונפוקלית הייתה מוגבלת לדימות רקמות לעומק של 100-200 מיקרומטר בשל ספיגת עירור פליטת קרינה פלואורסצנטית על ידי רקמת שמעליה 13 . למרות רקמות ניקוי, היסטולוגיה 3D נרחב תוארו בספרות ויש שיטות רבות בשביל לרקמות ניקוי רבים הם מתאימים לשימוש עם רקמות באופן כללי, כפי שהם נזק בלתי הפיך מורפולוגיה הסלולר דרך hyperhydration של חלבונים או הסרה של ליפידים. לכן, אין אפשרות לאמת כי תוצאות אלה הם המעידים של הרקמה עצמה, לא ממצאים עיבוד ואילו שלנו רקמות ניקוי תהליך היא טכניקה הפיך כי הוא מסוגל שמולן היסטולוגיה מסורתיים. בדרך כלל, ניקוי רקמות כרוך באחת משלוש גישות עיקריים: 1) התאמת אחיד של מדד השבירה (RI) של מרכיבי רקמת ידי ועלייתו RI התאמת פתרונות, אשר מסיר את פיזור אור המצטבר שנגרם כבידתי עקב רציפה התנודות של רי נמוך (ציטוזול) ומרכיבים RI (חלבון/שומנים) גבוהה; 2) הסרת מרכיבי השומנים דרך הטמעה לתוך הידרוג וניצול אלקטרופורזה/דיפוזיה להסיר את מרכיבי השומנים; 3) הרחבה/דנטורציה של חלבון מבנה כדי לאפשר חדירה מוגברת של ממיסים ולעודד אחידות של רי 13. בעוד גישות אלה ניתן לעיבוד רקמות שקוף, לאפשר ייצוגים תלת-ממד של סמנים ביולוגיים שיווצר, ייצוגים תלת-ממד אלה הם ערך קליני רב כמו זה מאתגר כדי לקבוע אם התמונות האלה מעידים על מאפייני הרקמה או של הרקמה תהליך ניקוי. מצד שני, מאז שלנו רקמות ניקוי הוא הפיך תקן היסטולוגית ו/או אימונוהיסטוכימיה ניתן ליישם את הרקמה זהה כדי להעריך אם התיקונים יש משמעות קלינית.
מחקר זה מציג ניתוח של 47 דוגמאות villous חלקית דיסטלי המתקבל סך של הריונות קלינית נורמלי, electively הסתיים 23 בין ההיריון של 9-23 שבועות השלים שני משלוחים מלא לטווח רגיל. Immunofluorescence תיוג של trophoblast ושל endothelia אפשרה ניתוח כמותי, אוטומטי של שינויים הרשתות וסקולרית villous חלקית את המורכבות שלהם.
עם פרוטוקול זה, אנו מבודדים, ניתח villi מסוף ורשתות נימי שלהם בקנה מידה בלתי אפשרי בעבר. גישה זו, כאשר חל פיתוח רשת נימי villous חלקית לאורך ההיריון יהיה לזהות מאפיינים אלה, המהווים הבסיס בלידת ילד בריא. כאשר מוחל על מחקרים של הריונות מסובך, זה נבאר גם כאשר, כיצד פתולוגיות היפרדות לשנות העצים villous חלקית של הרשתות הנימים הם נדן, וכיצד אלה לפגוע בעובר רווחה.
Protocol
Representative Results
Discussion
ועדת הבדיקה מוסדיים אישרה את האוסף של היפרדות רקמות villous חלקית עבור פורמלין קיבעון של הריונות שהופסקו electively. לפני ההליכים בוצעו, סקירה קצרה של הרשומה הרפואית ציין גיל אימהי, זוגיות, ואישר את העדר כל רפואי המשמש כבסיס (כגוןיתר לחץ דם, סוכרת, לופוס) או עוברית (מבנית או כרומוזומליות חריגות…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המשרד מדינת ניו יורק עבור אנשים עם נכויות התפתחותיות היפרדות Analytics LLC, רושל, ניו יורק.
Materials
| 10% Formaldehyde solution (w/v) in aqueous phosphate buffer | Macron Fine Chemicals | H-121-08 | General fixation agent, ready to use formula, use caution as vapors are toxic |
| Scalpel blades | ThermoFisher Scientific | 08-916-5B No. 11 | |
| Scalpel | ThermoFisher Scientific | 08-913-5 | |
| Fine forceps | Electron Microscopy Services | 78354-119 | |
| Micro Tube (1.7 mL) | PGC Scientifics | 505-201 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma | D8537 | PBS |
| Pipette | VWR | 52947-948 | disposable, 3ml transfer pipette |
| Triton X-100 | Boehriner Mannheim | 789 704 | Dilute to 0.1% from stock |
| Goat Serum | Gibco | 16210-064 | Dilute to 2% in PBS solution |
| Mouse monoclonial anti-ck7 Keratin 7 Ab-2 (Clone OV-TL 12/30) | ThermoFisher Scientific | MS-1352-RQ | |
| Rabbit Anti-CD31 antibody | Abcam | ab28364 | |
| green emitting (520 nm) fluorochrome | Invitrogen | A11017 | Alexa-Fluor 488 |
| infrared emitting (652 nm) fluorochrome | Invitrogen | A21072 | Alexa Fluor 633 |
| Ethanol alcohol 200 proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Dilute down to lower concentrations using PBS as needed |
| Solution-1 | Visikol Inc. | Visikol Histo-1 | |
| Solution-2 | Visikol Inc. | Visikol Histo-2 | |
| Skyes-Moore chambers | BellCo Glass Inc. | P/N 1943-11111 | |
| 25 gauge needle | ThermoFisher Scientific | 14-826AA | BD Precision Glide Needes |
| 3 mL syringe | ThermoFisher Scientific | 14-823-40 | BD disposable syringe |
| PDMS silicon sheets | McMaster-Carr | P/N 578T31 | |
| confocal microscope | Nikon Inc. | Nikon C1 Confocal Microscope | |
| Deconvolution software | Media Cybernetics | AutoQuant X22 | |
| Fiji image processing software | free, Open source software available at https://fiji.sc | ||
| Hematoxylin | Leica Biosystems | 3801570 | Component 1 of SelecTech H&E staining system |
| Alcoholic Eosin | Leica Biosystems | 3801615 | Component 2 of SelecTech H&E staining system |
| Blue Buffer | Leica Biosystems | 3802918 | Component 3 of SelecTech H&E staining system |
| Aqua Define MCX | Leica Biosystems | 3803598 | Component 4 of SelecTech H&E staining system |
| Immunohistochemistry detection system | ThermoFisher Scientific | TL-125-QHD | UltraVision Quanto Detection System HRP DAB |
References
- Thornburg, K. L., Kolahi, K., Pierce, M., Valent, A., Drake, R., Louey, S. Biological features of placental programming. Placenta. 48, 47-53 (2016).
- Misra, D. P., Salafia, C. M., Charles, A. K., Miller, R. K. Birth weights smaller or larger than the placenta predict BMI and blood pressure at age 7 years. J Dev Orig Health Dis. 1 (2), 123-130 (2010).
- Burton, G. J., Fowden, A. L., Thornburg, K. L. Placental Origins of Chronic Disease. Physiol Rev. 96 (4), 1509-1565 (2016).
- Srinivasan, A. P., Omprakash, B. O. P., Lavanya, K., Subbulakshmi Murugesan, P., Kandaswamy, S. A prospective study of villous capillary lesions in complicated pregnancies. J Pregnancy. 2014, 193925 (2014).
- Jones, C. J. P., Desoye, G. A new possible function for placental pericytes. Cells Tissues Organs. 194 (1), 76-84 (2011).
- Maly, A., Goshen, G., Sela, J., Pinelis, A., Stark, M., Maly, B. Histomorphometric study of placental villi vascular volume in toxemia and diabetes. Hum Pathol. 36 (10), 1074-1079 (2005).
- Ellery, P. M., Cindrova-Davies, T., Jauniaux, E., Ferguson-Smith, A. C., Burton, G. J. Evidence for transcriptional activity in the syncytiotrophoblast of the human placenta. Placenta. 30 (4), 329-334 (2009).
- Jirkovská, M., Kubínová, L., Janáček, J., Kaláb, J. 3-D study of vessels in peripheral placental villi. Image Anal Stereol. 26 (3), 165-168 (2011).
- Pearce, P., et al. Image-Based Modeling of Blood Flow and Oxygen Transfer in Feto-Placental Capillaries. PLOS ONE. 11 (10), 0165369 (2016).
- Plitman Mayo, R., Olsthoorn, J., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Computational modeling of the structure-function relationship in human placental terminal villi. J Biomech. 49 (16), 3780-3787 (2016).
- Mayhew, T. M. A stereological perspective on placental morphology in normal and complicated pregnancies. J Anat. 215 (1), 77-90 (2009).
- Teasdale, F. Gestational changes in the functional structure of the human placenta in relation to fetal growth: a morphometric study. Am J Obstet Gynecol. 137 (5), 560-568 (1980).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. J Exp Med. 99 (2), 167-182 (1954).
- Gill, J. S., Salafia, C. M., Grebenkov, D., Vvedensky, D. D. Modeling oxygen transport in human placental terminal villi. J Theor Biol. 291, 33-41 (2011).
- Plitman Mayo, R., Charnock-Jones, D. S., Burton, G. J., Oyen, M. L. Three-dimensional modeling of human placental terminal villi. Placenta. 43, 54-60 (2016).
