हम कॉर्नियल दाता स्ट्रोमा के उच्च गुणवत्ता मूल्यांकन के लिए एक विधि के रूप में पूर्ण-क्षेत्र ऑप्टिकल सुसंगतता माइक्रोस्कोपी के उपयोग का वर्णन करते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग स्वास्थ्य या बीमारी के संकेत देने वाली विशेषताओं की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, और इसका उद्देश्य दाता ऊतकों की स्क्रीनिंग और चयन में सुधार करना है, और इसलिए केराटोप्लास्टी के परिणाम।
दाता कॉर्नियल स्ट्रोमा की गुणवत्ता, जो कुल कॉर्नियल मोटाई का लगभग 90% बनाती है, गहरे पूर्ववर्ती लैमेलर और मर्मज्ञ केराटोप्लास्टी की सफलता के लिए मुख्य, यदि प्रमुख नहीं, सीमित कारकों में से एक होने की संभावना है। ये सर्जिकल प्रक्रियाएं हैं जिनमें हाल ही में मृत व्यक्ति से लिए गए दान किए गए ऊतक, ग्राफ्ट द्वारा क्रमशः रोगग्रस्त कॉर्नियल परतों के हिस्से या सभी को बदलना शामिल है। हालांकि, नेत्र बैंकों में कॉर्नियल ग्राफ्ट की स्ट्रोमल गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के साधन सीमित हैं और रोग संकेतकों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन मात्रात्मक मूल्यांकन की क्षमता की कमी है। फुल-फील्ड ऑप्टिकल सुसंगतता माइक्रोस्कोपी (एफएफ-ओसीएम), ताजा या निश्चित पूर्व विवो जैविक ऊतक नमूनों के उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी इमेजिंग की अनुमति देता है, एक गैर-इनवेसिव तकनीक है जो दाता कॉर्निया मूल्यांकन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। यहां हम एफएफ-ओसीएम का उपयोग करके कॉर्नियल स्ट्रोमा के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक सामान्य दाता कॉर्निया और पैथोलॉजिकल कॉर्नियल बटन पर लागू किया गया है, और इसका उपयोग मैक्रोस्कोपिक और माइक्रोस्कोपिक दोनों स्तरों पर स्वस्थ और पैथोलॉजिकल विशेषताओं की पहचान करने के लिए किया जा सकता है, जिससे स्ट्रोमल विकारों का पता लगाने की सुविधा मिलती है जो केराटोप्लास्टी के परिणाम से समझौता कर सकते हैं। ग्राफ्ट गुणवत्ता नियंत्रण में सुधार करके, इस प्रोटोकॉल में दाता ऊतकों के बेहतर चयन (और अस्वीकृति) के परिणामस्वरूप होने की क्षमता है और इसलिए ग्राफ्ट विफलता में कमी आई है।
कॉर्नियल रोग दुनिया भर में अंधापन के प्रमुख कारणों में से हैं। कुछ बीमारियों का इलाज केवल शल्य चिकित्सा द्वारा किया जा सकता है, जिसमें अक्सर हाल ही में मृत व्यक्ति से लिए गए दान किए गए ऊतक, ग्राफ्ट द्वारा भाग (यानी, लैमेलर केराटोप्लास्टी) या पूरे (यानी, केराटोप्लास्टी को भेदने वाले) रोगग्रस्त कॉर्निया के प्रतिस्थापन को शामिल किया जाता है। कॉर्नियल रोगों के लिए जो एंडोथेलियम (जैसे, केराटोकोनस, संक्रामक केराटाइटिस, आघात और स्ट्रोमल डिस्ट्रोफी के बाद स्ट्रोमल निशान) को प्रभावित नहीं करते हैं, वर्तमान में डीप एंटीरियर लैमेलर केराटोप्लास्टी (डीएएलके) को पसंद 2,3,4,5 की सर्जिकल तकनीक के रूप में माना जाता है। यह तकनीक केवल केंद्रीय कॉर्नियल एपिथेलियम और स्ट्रोमा को प्रतिस्थापित करके प्राप्तकर्ता के कॉर्नियल एंडोथेलियम के संरक्षण को संभव बनाती है, जो ग्राफ्ट अस्वीकृति की कम घटनाओं, एंडोथेलियल अस्वीकृति की अनुपस्थिति, कम एंडोथेलियल सेल हानि और अनुकूल लागत-प्रभावशीलता अनुपात 6,7,8,9,10,11 से जुड़ी है। . डीएएलके आगे इष्टतम एंडोथेलियम गुणवत्ता से कम वाले कॉर्निया को ग्राफ्ट के रूप में उपयोग करने की अनुमति देता है, क्योंकि इस समझौता परत कोप्रत्यारोपित नहीं किया जाएगा। इसके विपरीत, दाता कॉर्नियल स्ट्रोमा की गुणवत्ता ग्राफ्ट सफलता और दृष्टि वसूली के लिए प्रमुख सीमित कारक होने की संभावना है क्योंकि स्ट्रोमा एकमात्र दाता कॉर्नियल परत है, जबकि दाता उपकला को प्राप्तकर्ता उपकला द्वारा प्रतिस्थापित किया जाएगा। दुर्भाग्य से, आंखों के बैंकों में दाता कॉर्नियल स्ट्रोमा का आकलन करने के साधन सीमित हैं। वे आमतौर पर दाता नेत्रगोलक की स्लिट-लैंप परीक्षा शामिल करते हैं जब ऊतक पुनर्प्राप्ति दाता स्ट्रोमा13 के न्यूक्लियेशन और प्रकाश माइक्रोस्कोप परीक्षा द्वारा की जाती है। कुछ नेत्र बैंकों ने फूरियर-डोमेन ऑप्टिकल समेकन टोमोग्राफी (एफडी-ओसीटी) 14 का उपयोग करके ऐसी मानक प्रक्रियाओं को पूरक करना शुरू कर दिया है।
नेत्र ऑप्टिकल सुसंगतता टोमोग्राफी (ओसीटी), अल्ट्रासाउंड इमेजिंग15 के लिए एक ऑप्टिकल एनालॉग, रेटिना16 और पूर्ववर्ती खंड17 के ऑप्टिकल वर्गों को उत्पन्न करने के लिए ब्रॉडबैंड या असमर्थ प्रकाश के हस्तक्षेप का उपयोग करता है। टाइम-डोमेन ओसीटी में, प्रारंभिक नैदानिक प्रणालियों का आधार, एक संदर्भ दर्पण की स्थिति बदल दी जाती है, ताकि हस्तक्षेप पैटर्न तब दिखाई दें जब भी संदर्भ बीम ने विभिन्न ऊतक इंटरफेस पर प्रतिबिंबित बीम के रूप में लगभग समान समय की यात्रा की हो, जिसमें ए-स्कैन समय के कार्य के रूप में उत्पन्न होते हैं। एफडी-ओसीटी (जिसे वर्णक्रमीय- या आवृत्ति-डोमेन ओसीटी भी कहा जाता है) में, अधिकांश आधुनिक नैदानिक प्रणालियों का आधार, संदर्भ दर्पण एक स्थिति में तय किया जाता है और एक व्यक्तिगत ए-स्कैन, जिसमें सभी हस्तक्षेप पैटर्न एक साथ मिश्रित होते हैं, एक समय में अधिग्रहित किए जाते हैं, और फूरियर विश्लेषण के माध्यम से अलग-अलग विच्छेदित होते हैं।
जबकि नैदानिक (समय या वर्णक्रमीय-डोमेन) ओसीटी सिस्टम कॉर्निया के क्रॉस-अनुभागीय दृश्यों और स्लिट-लैंप बायोमाइक्रोस्कोपी की तुलना में उच्च अक्षीय रिज़ॉल्यूशन पर स्ट्रोमल ओपेसिटी का पता लगाने की अनुमति देते हैं, उनका पार्श्व संकल्प सीमित है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी18 हिस्टोलॉजिकल विवरण के करीब एक पार्श्व रिज़ॉल्यूशन पर कॉर्निया की परीक्षा की अनुमति देता है, लेकिन अक्षीय रूप से सीमित है।
पूर्ण-क्षेत्र ऑप्टिकल सुसंगतता टोमोग्राफिक माइक्रोस्कोपी (एफएफ-ओसीटी या एफएफ-ओसीएम) 19,20 कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और ओसीटी दोनों के तत्वों को जोड़ती है, जो लगभग 1 μm के अक्षीय रिज़ॉल्यूशन के बराबर पार्श्व संकल्प प्राप्त करती है। अधिक विशेष रूप से, एफएफ-ओसीएम पार्श्व स्कैनिंग के बिना फेस 2 डी टोमोग्राफिक छवियों को प्राप्त करने के लिए असंगत ब्रॉडबैंड प्रकाश स्रोतों (जैसे, एक हलोजन लैंप) और उच्च संख्यात्मक एपर्चर ऑप्टिक्स का उपयोग करता है। गहराई की दिशा में स्कैन करके, एफएफ-ओसीएम ताजा या निश्चित पूर्व विवो जैविक ऊतक नमूनों के गैर-इनवेसिव 3 डी इमेजिंग को सक्षम बनाता है। इसका उपयोग कॉर्निया21,22,23 की छवि बनाने के लिए किया गया है। चेहरे और क्रॉस-अनुभागीय दृश्यों दोनों को उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रदान करके, एफएफ-ओसीएम कॉर्निया की हिस्टोलॉजिकल संरचना और सेलुलर विवरण दोनों पर जानकारी प्रदान करता है। वास्तव में, एफएफ-ओसीएम को हिस्टोलॉजी से बेहतर संरचनात्मक जानकारी प्रदान करने के लिए दिखाया गया है और वर्णक्रमीय-डोमेन ओसीटी और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी24,25 के संयोजन के साथ संभव रूप से अधिक रोग संकेतकों की पहचान करने में सक्षम था।
यहां हम एफएफ-ओसीएम का उपयोग करके कॉर्नियल दाता स्ट्रोमा के गुणात्मक और मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। यह विधि स्ट्रोमल स्थिति के संकेत देने वाले मैक्रोस्कोपिक और सूक्ष्म विशेषताओं के हिस्टोलॉजी जैसे विश्लेषण पर आधारित है, जिसमें तीन मात्रात्मक स्ट्रोमल पैरामीटर (यानी, बोमन की परत मोटाई और इसकी परिवर्तनशीलता, और स्ट्रोमल परावर्तकता) शामिल हैं। इसलिए वर्णित प्रोटोकॉल सामान्य और असामान्य कॉर्निया ऊतकों पर लागू होता है और सामान्य मानव कॉर्नियल ऊतकों से रोगग्रस्त के भेदभाव की अनुमति देता है।
एफएफ-ओसीएम का उपयोग करके कॉर्नियल डोनर स्ट्रोमा के गुणात्मक और मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए यहां वर्णित प्रोटोकॉल स्पेक्ट्रल-डोमेन ओसीटी और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी21,24,25 की क्षमताओं से परे, स्ट्रोमल स्थिति के संकेत वाले मैक्रोस्कोपिक और माइक्रोस्कोपिक विशेषताओं के हिस्टोलॉजी जैसे विश्लेषण पर आधारित है, और सामान्य मानव ऊतकों से रोगग्रस्त के भेदभाव को सक्षम बनाता है।
स्पेकुलर माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मानव दाता कॉर्निया के उत्कृष्ट एंडोथेलियल गुणवत्ता मूल्यांकन के अलावा, स्ट्रोमल गुणवत्ता का आकलन आंखों के बैंकों में चुनौतीपूर्ण है, और आम तौर पर वर्तमान प्रोटोकॉल में स्लिट-लैंप बायोमाइक्रोस्कोपी और / या प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ सकल अवलोकन तक सीमित है। मौजूदा तरीकों के साथ ठीक समाधान की कमी का मतलब न केवल यह है कि कुछ स्ट्रोमल रोग वाले कॉर्निया का चयन किया जा सकता है जो केराटोप्लास्टी के परिणाम से समझौता करते हैं, बल्कि यह भी कि कॉर्निया को स्ट्रोमल ओपेसिटी के लिए अस्वीकार कर दिया जा सकता है जो वास्तव में पूर्ववर्ती स्ट्रोमा या उपकला क्षेत्रों के लिए बाधा हैं और अभी भी एंडोथेलियल केराटोप्लास्टी प्रक्रियाओंके लिए उपयोग किया जा सकता है।
वर्तमान आई-बैंक प्रोटोकॉल को एफएफ-ओसीएम के अलावा पूरक किया जा सकता है, जो अपने बेहतर रिज़ॉल्यूशन के कारण, कॉर्निया, विशेष रूप से स्ट्रोमा (बोमन की परत सहित) के गुणवत्ता मूल्यांकन को पूरा करने के लिए एक शक्तिशाली और गैर-इनवेसिव उपकरण का गठन करता है। स्लिट-लैंप परीक्षा के विपरीत, ग्राफ्ट एफएफ-ओसीएम छवि अधिग्रहण के दौरान भंडारण माध्यम से भरे एक बंद कक्ष में डूबा रहता है, जिससे संदूषण का कोई संभावित जोखिम कम हो जाता है।
एफएफ-ओसीएम के साथ सफल छवि अधिग्रहण के लिए ( सामग्री की तालिका देखें), माइक्रोस्कोप उद्देश्य के लिए ऑप्टिकल जेल में अच्छी तरह से डूबा होना महत्वपूर्ण है जो नमूना धारक (चरण 2.2.3) के कवरस्लिप के शीर्ष पर लागू होता है। आगे डिवाइस के अंशांकन की नियमित रूप से जांच करने की सिफारिश की जाती है, एक प्रक्रिया जिसे असफल ऑटो-समायोजन (चरण 2.2.2) के बाद भी किया जाना चाहिए और अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में “उपकरण और विकल्प” के माध्यम से एक्सेस किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)। प्रक्रिया, जिसमें नमूना धारक में अंशांकन दर्पण का उपयोग शामिल है, सामान्य नमूना तैयारी के समान है (चरण 1.2 देखें) सिवाय इसके कि ऑप्टिकल जेल को कवरस्लिप की स्थिति से पहले दर्पण पर लागू किया जाना चाहिए।
दाता कॉर्नियल ग्राफ्ट की एक श्रृंखला, जिसे मौजूदा आई-बैंक प्रक्रियाओं के अनुसार सामान्य स्ट्रोमा माना जाता है, का उपयोग इस पांडुलिपि में प्रोटोकॉल का वर्णन करने और विशेष रूप से दाता स्ट्रोमल गुणवत्ता के सटीक और विश्वसनीय मूल्यांकन के लिए एफएफ-ओसीएम की उपयुक्तता को प्रदर्शित करने के लिए किया गया था। इन सामान्य दाता कॉर्निया की तुलना भंडारण माध्यम में डूबे पैथोलॉजिकल कॉर्निया के साथ की गई थी, जिसमें दिखाया गया था कि हिस्टोलॉजी जैसे विश्लेषण ने कॉर्नियल ग्राफ्ट में कई स्ट्रोमल विशेषताओं (चित्रा 2, चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5, चित्रा 6, चित्रा 7, और चित्रा 8 में चित्रित) के एफएफ-ओसीएम के साथ संभव बनाया।
रूपात्मक परिवर्तनों के अलावा, जैसे निशान (चित्रा 5 और चित्रा 7), फाइब्रोटिक ऊतक (चित्रा 8), झीलें (चित्रा 2), वोग्ट स्ट्रिया (चित्रा 4), या बढ़े हुए स्ट्रोमल तंत्रिका व्यास (चित्रा 4), रोगग्रस्त कॉर्निया में विशिष्ट स्ट्रोमल विशेषताएं मौजूद हैं। स्ट्रोमल गुणवत्ता मूल्यांकन में विशेष रूप से प्रासंगिक स्ट्रोमल पैरामीटर बोमन की परत की मोटाई और इसकी परिवर्तनशीलता, और स्ट्रोमल परावर्तकता प्रतीत होते हैं। प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम इस प्रकार चरण 4.1 और 4.3 हैं।
मानव कॉर्नियल विकास के दौरान स्रावित होने के दौरान, बोमन की परत, विशेष रूप से, 19 सप्ताह के गर्भ से अलग हो जाती है और जन्म32 के बाद कभी भी मरम्मत नहीं करती है। बोमन की परत को नुकसान इस प्रकार अपरिवर्तनीय है और दाता कॉर्नियल ऊतक में पिछले स्ट्रोमल क्षति के आदर्श संकेतक के रूप में कार्य करता है, जिसमें अपवर्तक सर्जरी, संक्रामक केराटाइटिस, केराटोकोनस के कारण होने वाली क्षति शामिल है। इस तरह के कॉर्नियल रोग, जो दाता कॉर्नियल उपयोग के लिए मतभेद ों का गठन करते हैं, रुकावट और निशान के कारण बोमन की परत की मोटाई में कमी और चर के साथ जुड़े होते हैं (चित्रा 5), और वर्तमान आंख-बैंक प्रोटोकॉल द्वारा याद किए जाने की संभावना है जब दाता इतिहास ठीक से ज्ञात नहीं होता है।
यद्यपि पोस्ट मॉर्टम कॉर्नियल एडिमा के कारण दाता की मृत्यु के बाद कॉर्नियल पारदर्शिता बिगड़ जाती है, लेकिन बैकस्प्रेटेड प्रकाश, या स्ट्रोमल परावर्तकता की मात्रा स्ट्रोमा में गहराई के साथ तेजी से कम होने की उम्मीद है ( चित्रा 3 और चित्रा 4 ए देखें); नतीजतन, सामान्यीकृत स्ट्रोमल परावर्तकता का लघुगणक सामान्य दाता कॉर्निया में स्ट्रोमल गहराई का एक रैखिक कार्य होगा, जिसे 1 के करीब आर-स्क्वायर मानों द्वारा दर्शाया जाएगा। इसके विपरीत, मैक्रोस्कोपिक विशेषताओं की उपस्थिति गैर-रैखिक लघुगणकीय गहराई प्रोफाइल और स्ट्रोमल रोग (चित्रा 4 बी और चित्रा 7)25 के संकेत से जुड़ी है।
चूंकि केराटोसाइट घनत्व स्ट्रोमल कोलेजन फाइब्रिल और बाह्य मैट्रिक्स संश्लेषण और नवीकरण के लिए जिम्मेदार है, इसलिए यह मानना उचित प्रतीत होता है कि दाता स्ट्रोमल गुणवत्ता का आकलन करने के लिए केराटोसाइट घनत्व एक और प्रासंगिक पैरामीटर है, और यह कि बहुत कम केराटोसाइट गिनती का प्रदर्शन करने वाले ऊतकों को प्रत्यारोपित नहीं किया जाना चाहिए। इसलिए प्रोटोकॉल में एफएफ-ओसीएम छवियों से केराटोसाइट घनत्व को मापने के लिए एक सटीक और विश्वसनीय विधि शामिल है जिसे आसानी से आंखों के बैंक25 में उपयोग किया जा सकता है और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के सम्मेलन का पालन करता है। ध्यान दें कि एफएफ-ओसीएम के साथ, केराटोसाइट घनत्व को क्रॉस-सेक्शनल व्यू33 में सीधे केराटोसाइट्स की गिनती करके भी निर्धारित किया जा सकता है, जो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी पर एक संभावित लाभ है, जिसके लिए केराटोसाइट्स को कई एन फेस स्लाइस पर गिना जाना आवश्यक है। हालांकि, जीवित रोगियों के विपरीत, जहां केराटोसाइट घनत्व सामान्य नियंत्रण34,35,36,37 की तुलना में रोग रोगियों में कम दिखाया गया है और रोग की गंभीरता34,38 के साथ सहसंबंधित है, मानव पूर्व विवो ऊतक नमूने25 में ऐसा नहीं था। , और यह निर्धारित करने के लिए आगे के अध्ययन आवश्यक हैं कि प्रत्यारोपण के बाद अच्छी दृश्य वसूली के परिणामस्वरूप दाता कॉर्निया में केराटोसाइट्स की न्यूनतम संख्या की आवश्यकता होती है या नहीं। पैथोलॉजिकल ऊतक के रूप में दाता ऊतक में कम केराटोसाइट घनत्व को उम्र बढ़ने, इस्केमिया से प्रेरित कोशिकाओं के पोस्टमार्टम नुकसान और / या दाता ऊतक 27,39,40,41 के भंडारण से समझाया जा सकता है। यह भी बताया जाना चाहिए कि इस प्रोटोकॉल में प्राप्त और चित्रित किए गए सामान्य दाता कॉर्निया को या तो संग्रहीत और एडेमेटस या डी-बूस्ट किया गया था, या यूरोपीय संघ के आई बैंक एसोसिएशन के मानकों के अनुसार खराब एंडोथेलियल गुणवत्ता के कारण प्रत्यारोपण से पहले नेत्र बैंक द्वारा छोड़ दिया गया था। यदि एफएफ-ओसीएम इमेजिंग को आंखों के बैंक सेटिंग में शामिल करने के लिए वर्णित प्रोटोकॉल के साथ किया जाता है, तो कॉर्निया का मूल्यांकन आमतौर पर यहां संभव होने की तुलना में एक ताजा स्थिति में किया जाएगा, जो केराटोसाइट घनत्व को प्रभावित कर सकता है।
स्ट्रोमल गुणवत्ता विश्लेषण के लिए यहां वर्णित प्रोटोकॉल को डेसेमेट की झिल्ली के मूल्यांकन के लिए बढ़ाया जा सकता है, जिसे मोटाई और संरचना21,24 के संदर्भ में एफएफ-ओसीएम के साथ भी हल किया जा सकता है। यह डेसेमेट की झिल्ली एंडोथेलियल केराटोप्लास्टी के लिए ऊतकों के चयन के लिए उपयोगी साबित हो सकता है, जहां पतली डेसेमेट की झिल्ली को स्ट्रोमा से अलग करना अधिक कठिन हो सकता है।
अंत में, एफएफ-ओसीएम भंडारण के दौरान मानव दाता कॉर्नियल स्ट्रोमा के सटीक और विश्वसनीय मूल्यांकन को सक्षम बनाता है। ग्राफ्ट गुणवत्ता में सुधार करके, वर्तमान नेत्र-बैंकिंग प्रक्रियाओं में इस प्रोटोकॉल के अतिरिक्त दाता ऊतकों की स्क्रीनिंग और चयन में सुधार करने की क्षमता है, और इसलिए केराटोप्लास्टी के परिणाम हैं। आई-बैंक रूटीन में एफएफ-ओसीएम डिवाइस के वास्तविक जीवन एकीकरण को हाल के तकनीकी अपडेट द्वारा सुविधाजनक बनाया जाना चाहिए, जिसमें कस्टम सीएमओएस कैमरे के विकास के लिए तेजी से छवि अधिग्रहण और बड़े क्षेत्र और इमेजिंग के दौरान कॉर्निया भंडारण और हैंडलिंग के लिए कस्टम बाँझ डिस्पोजेबल कैसेट का डिजाइन शामिल है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को एजेंस नेशनल डी रेचरचे (एएनआर), एक पीआरटीएस (प्रोजेट डी रेचरचे ट्रांसलेशने एन सैंटे) अनुदान संख्या एएनआर -13-पीआरटीएस -0009 (वीबी) के तहत और यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से मैरी स्कोडोव्स्का-क्यूरी अनुदान समझौते नंबर 709104 (केआई) के तहत धन प्राप्त हुआ है। लेखक सेल गिनती और हिस्टोलॉजिकल प्रोसेसिंग में मदद के लिए सेलिन डी सूसा को धन्यवाद देते हैं।
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