Vi beskriver bruk av fullfelts optisk koherensmikroskopi som metode for kvalitetsvurdering av hornhinnedonorstroma. Denne protokollen kan brukes til å identifisere egenskaper som indikerer helse eller sykdom, og er rettet mot å forbedre screening og utvalg av donorvev, og dermed resultatene av keratoplastikk.
Kvaliteten på donor hornhinne stroma, som utgjør ca 90% av total hornhinnetykkelse, er sannsynligvis en av de viktigste, om ikke den viktigste, begrensende faktoren (e) for suksess av dyp fremre lamellar og penetrerende keratoplastikk. Dette er kirurgiske prosedyrer som innebærer å erstatte en del eller alle de syke hornhinnelagene, henholdsvis av donert vev, transplantatet, tatt fra en nylig avdød person. Imidlertid er midler til å evaluere stromalkvalitet av hornhindetransplantater i øyebanker begrenset og mangler evnen til høyoppløselig kvantitativ vurdering av sykdomsindikatorer. Fullfelt optisk koherensmikroskopi (FF-OCM), som tillater høyoppløselig 3D-avbildning av ferske eller faste ex vivo biologiske vevsprøver, er en ikke-invasiv teknikk som er godt egnet for vurdering av donorhornhinnen. Her beskriver vi en metode for kvalitativ og kvantitativ analyse av hornhinnestroma ved bruk av FF-OCM. Protokollen har blitt brukt på normale donorhornhinner og patologiske hornhinneknapper, og kan brukes til å identifisere sunne og patologiske egenskaper på både makroskopisk og mikroskopisk nivå, og dermed lette påvisning av stromale lidelser som kan kompromittere utfallet av keratoplastikk. Ved å forbedre kvalitetskontrollen av transplantat, har denne protokollen potensial til å resultere i bedre utvelgelse (og avvisning) av donorvev og dermed redusert transplantatsvikt.
Hornhinnesykdommer er blant de viktigste årsakene til blindhet over hele verden1. Noen sykdommer kan bare behandles kirurgisk, ofte involverer utskifting av del (dvs. lamellar keratoplastikk) eller hele (dvs. penetrerende keratoplastikk) syk hornhinne, av donert vev, transplantatet, tatt fra en nylig avdød person. For hornhinnesykdommer som ikke påvirker endotelet (f.eks. keratokonus, stromale arr etter infeksiøs keratitt, traumer og stromale dystrofier), anses dyp fremre lamellar keratoplastikk (DALK) for tiden som den kirurgiske teknikken av valg 2,3,4,5. Denne teknikken muliggjør bevaring av mottakerens hornhinneendotel ved å erstatte bare det sentrale hornhinneepitelet og stroma, som er forbundet med en lavere forekomst av transplantatavvisning, fravær av endotelavvisning, lavere endotelcelletap og gunstig kostnadseffektivitetsforhold 6,7,8,9,10,11 . DALK tillater videre hornhinner med mindre enn optimal endotelkvalitet som skal brukes som transplantater, da dette kompromitterte laget ikke vil bli transplantert12. Omvendt er kvaliteten på donor hornhinne stroma sannsynligvis den viktigste begrensende faktoren for graftsuksess og syngjenoppretting fordi stroma er det eneste donorhornhinnelaget som forblir, mens donorepitelet vil bli erstattet av mottakerepitel. Dessverre er midler til å vurdere donor hornhinne stroma i øyebanker begrenset. De inkluderer vanligvis spaltelampeundersøkelse av donorøyebollet når vevsuthenting gjøres ved enukleasjon og lysmikroskopundersøkelse av donorstroma13. Noen øyebanker har begynt å supplere slike standardprosedyrer ved hjelp av Fourier-domene optisk koherenstomografi (FD-OCT)14.
Oftalmisk optisk koherenstomografi (OCT), en optisk analog til ultralydavbildning15, bruker interferens av bredbånd eller justerbart lys for å generere optiske seksjoner av retina 16 og fremre segment17. I tidsdomene OCT, grunnlaget for tidlige kliniske systemer, endres posisjonen til et referansespeil, slik at interferensmønstre dukker opp når referansestrålen har reist nesten like mye tid som strålen reflektert ved de forskjellige vevsgrensesnittene, med A-skanninger generert som en funksjon av tid. I FD-OCT (også kalt spektral- eller frekvensdomene OCT), grunnlaget for de fleste moderne kliniske systemer, er referansespeilet festet i en posisjon og en individuell A-skanning, med alle interferensmønstre blandet sammen, erverves om gangen og dissekeres fra hverandre via Fourier-analyse.
Mens kliniske (tids- eller spektraldomene) OCT-systemer tillater tverrsnittsvisning av hornhinnen og påvisning av stromale fortetninger ved høyere aksial oppløsning enn spaltelampebiomikroskopi, er deres laterale oppløsning begrenset. Konfokalmikroskopi18 gjør det mulig å undersøke hornhinnen ved en lateral oppløsning som nærmer seg histologisk detalj, men er begrenset aksialt.
Fullfelt optisk koherens tomografisk mikroskopi (FF-OCT eller FF-OCM)19,20 kombinerer elementer fra både konfokalmikroskopi og OCT, og oppnår en lateral oppløsning sammenlignbar med den aksiale oppløsningen på ca. 1 μm. Mer spesifikt bruker FF-OCM usammenhengende bredbåndslyskilder (f.eks. en halogenlampe) og optikk med høy numerisk blenderåpning for å skaffe seg 2D-tomografiske bilder uten sideskanning. Ved å skanne i dybderetningen muliggjør FF-OCM ikke-invasiv 3D-avbildning av ferske eller faste ex vivo biologiske vevsprøver. Det har blitt brukt til å avbilde hornhinnen21,22,23. Ved å gi både høyoppløselige en ansikts– og tverrsnittsvisninger, gir FF-OCM informasjon om både den histologiske strukturen og cellulære detaljer i hornhinnen. Faktisk har FF-OCM vist seg å gi strukturell informasjon overlegen histologi og var i stand til å identifisere flere sykdomsindikatorer som var mulig med kombinasjonen av spektraldomene OCT og konfokal mikroskopi24,25.
Her beskriver vi en protokoll for kvalitativ og kvantitativ vurdering av hornhinnedonorstroma ved bruk av FF-OCM. Metoden er basert på histologilignende analyse av makroskopiske og mikroskopiske trekk som indikerer stromaltilstand, inkludert tre kvantitative stromale parametere (dvs. Bowmans lagtykkelse og dens variabilitet og stromalreflektivitet). Den beskrevne protokollen brukes derfor på normalt og unormalt hornhinnevev og tillater differensiering av syke fra normalt humant hornhinnevev.
Protokollen beskrevet her for kvalitativ og kvantitativ vurdering av hornhinnedonorstroma ved bruk av FF-OCM er basert på histologilignende analyse av makroskopiske og mikroskopiske trekk som indikerer stromaltilstand, utover mulighetene til spektraldomene OCT og konfokalmikroskopi21,24,25, og muliggjør differensiering av syke fra normalt humant vev.
Bortsett fra en utmerket endotelkvalitetsvurdering av humane donorhornhinner ved hjelp av spekulær mikroskopi, er vurdering av stromalkvalitet utfordrende i øyebanker, og generelt begrenset til en grov observasjon med spaltelampebiomikroskopi og / eller lysmikroskopi i gjeldende protokoller. Mangel på fin oppløsning med eksisterende metoder betyr ikke bare at hornhinner med noen stromalsykdom kan velges som kompromitterer resultatet av keratoplastikk, men også at hornhinner kan avvises for stromale fortetninger som faktisk er begrenset til fremre stroma eller epitelregioner og fortsatt kan brukes til endotelial keratoplastikkprosedyrer14.
Den nåværende øyebankprotokollen kan suppleres med tillegg av FF-OCM, som på grunn av sin overlegne oppløsning utgjør et kraftig og ikke-invasivt verktøy for å fullføre kvalitetsvurderingen av hornhinnen, spesielt stroma (inkludert Bowmans lag). I motsetning til under spaltelampeundersøkelse forblir transplantatet nedsenket i et lukket kammer fylt med lagringsmedium gjennom hele FF-OCM bildeopptak, noe som reduserer potensiell risiko for forurensning.
For vellykket bildeopptak med FF-OCM (se materialfortegnelse) er det viktig at mikroskopmålet er godt nedsenket i den optiske gelen som påføres på toppen av prøveholderens deksel (trinn 2.2.3). Det anbefales videre å regelmessig kontrollere kalibreringen av enheten, en prosedyre som også skal utføres etter mislykket automatisk justering (trinn 2.2.2) og åpnes via “Verktøy og alternativer” i anskaffelsesprogramvaren (se Materialfortegnelse). Prosedyren, som innebærer bruk av et kalibreringsspeil i prøveholderen, er den samme som vanlig prøvepreparering (se trinn 1.2), bortsett fra at den optiske gelen skal påføres speilet før dekkslipen plasseres.
En serie donorhornhinnetransplantater, som anses å ha normal stroma i henhold til eksisterende øyebankprosedyrer, ble brukt til å beskrive protokollen i dette manuskriptet og spesifikt demonstrere egnetheten til FF-OCM for presis og pålitelig vurdering av donorstromalkvalitet. Disse normale donorhornhinnene ble sammenlignet med patologiske hornhinner nedsenket i lagringsmedium, noe som viste at den histologilignende analysen muliggjorde med FF-OCM av flere stromale trekk (illustrert i figur 2, figur 3, figur 4, figur 5, figur 6, figur 7 og figur 8) i hornhinnetransplantater gjør det mulig å skille syke fra normale humane hornhinnevev.
Bortsett fra morfologiske forandringer, som tilstedeværelse av arr (figur 5 og figur 7), fibrotisk vev (figur 8), innsjøer (figur 2), Vogt striae (figur 4) eller økt stromalnervediameter (figur 4), er typiske stromale trekk til stede i syke hornhinner. Stromal parametere som er spesielt relevante i den stromale kvalitetsvurderingen synes å være Bowmans lagtykkelse og dens variabilitet, og stromal reflektivitet. Kritiske trinn i protokollen er dermed trinn 4.1 og 4.3.
Mens det blir utskilt under menneskelig hornhinneutvikling, blir spesielt Bowmans lag tydelig ved 19 ukers svangerskap og reparerer aldri etter fødselen32. Skader på Bowmans lag er dermed irreversible og fungerer som en ideell indikator på tidligere stromalskade i donorhornhinnevev, inkludert skade forårsaket av brytningskirurgi, infeksiøs keratitt, keratokonus. Slike hornhinnesykdommer, som utgjør kontraindikasjoner for donorhornhinnebruk, er forbundet med redusert og variabel Bowmans lagtykkelse på grunn av avbrudd og arrdannelse (figur 5), og vil sannsynligvis bli savnet av gjeldende øyebankprotokoller når donorhistorikken ikke er nøyaktig kjent.
Selv om hornhinnens gjennomsiktighet er svekket etter donordød på grunn av post mortem hornhinneødem, forventes mengden tilbakespredt lys eller stromalreflektivitet å avta eksponentielt med dybden i stroma (se figur 3 og figur 4A); som et resultat vil logaritmen til normalisert stromalreflektivitet være en lineær funksjon av stromaldybde i normale donorhornhinner, representert ved R-kvadratverdier nær 1. Omvendt er tilstedeværelsen av makroskopiske trekk assosiert med ikke-lineære logaritmiske dybdeprofiler og indikerer stromalsykdom (figur 4B og figur 7)25.
Siden keratocytttetthet er ansvarlig for stromal kollagenfibriller og ekstracellulær matrikssyntese og fornyelse, synes det rimelig å anta at keratocytttetthet er en annen relevant parameter for å vurdere donorstromalkvalitet, og at vev med svært lavt keratocyttall ikke bør transplanteres. Protokollen inneholder derfor en presis og pålitelig metode for å måle keratocytttetthet fra FF-OCM-bilder som enkelt kan brukes i øyebanker25 og følger konvensjonen for konfokalmikroskopi. Merk at med FF-OCM kan keratocytttettheten også bestemmes ved å telle keratocytter direkte i tverrsnittsvisning33, en potensiell fordel i forhold til konfokal mikroskopi, som krever at keratocytter telles på flere ansiktsskiver. Imidlertid, i motsetning til hos levende pasienter, hvor keratocytttetthet har vist seg å være lavere hos sykdomspasienter enn hos normale kontroller 34,35,36,37 og å korrelere med sykdommens alvorlighetsgrad 34,38, var dette ikke tilfelle i humane ex vivo vevsprøver 25 , og videre studier er nødvendige for å avgjøre om et minimalt antall keratocytter er nødvendig i donorhornhinner for å resultere i god visuell utvinning etter transplantasjon. Lav keratocytttetthet i donorvev som i patologisk vev kunne forklares med aldring, post mortem-tap av celler indusert av iskemi og/eller lagring av donorvev 27,39,40,41. Det bør også påpekes at de normale donorhornhinnene som ble oppnådd og avbildet i denne protokollen, enten ble lagret og edematøse eller de-hovne, eller hadde blitt kassert av øyebanken før transplantasjon på grunn av dårlig endotelkvalitet i henhold til standardene til EU Eye Bank Association. Hvis FF-OCM-avbildning sammen med den beskrevne protokollen skulle inkluderes i øyebankinnstillingen, ville hornhinnene typisk bli vurdert i en friskere tilstand enn det som var mulig her, noe som kan påvirke keratocytttetthetene.
Protokollen beskrevet her for den stromale kvalitetsanalysen kan utvides for vurdering av Descemets membran, som også kan løses med FF-OCM når det gjelder tykkelse og struktur21,24. Dette kan være nyttig for seleksjon av vev for Descemets membranendotelial keratoplastikk, hvor tynne Descemets membraner kan være vanskeligere å skille fra stroma.
Avslutningsvis muliggjør FF-OCM presis og pålitelig vurdering av human donor hornhinnestroma under lagring. Ved å forbedre graftkvaliteten har tillegg av denne protokollen til dagens øyebankprosedyrer potensial til å forbedre screening og valg av donorvev, og dermed resultatene av keratoplastikk. Virkelig integrering av FF-OCM-enheten i øyebankrutinen bør tilrettelegges av nylige teknologiske oppdateringer, inkludert raskere bildeopptak og større synsfelt takket være utviklingen av et tilpasset CMOS-kamera, og utformingen av tilpassede sterile engangskassetter for lagring og håndtering av hornhinnen under bildebehandling.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet har mottatt finansiering fra Agence Nationale de Recherche (ANR), under en PRTS (Projet de Recherche Translationelle en Santé) grant No ANR-13-PRTS-0009 (V.B.) og fra EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram under Marie Skłodowska-Curie grant agreement No 709104 (K.I.). Forfatterne takker Céline de Sousa for hjelp med celletelling og histologisk prosessering.
Light-CT Scanner | LLTech, France | http://www.lltechimaging.com/products-applications/products/ | FF-OCM device used in this manuscript for imaging |
CorneaJet | EuroBio, France | http://www.eurobio-cornea.com/en/corneamax-10-100-ml-xml-352-822.html | Organ culture medium in which donor corneas are stored |
CorneaMax | EuroBio, France | http://www.eurobio-cornea.com/en/corneajet-10-50-ml-xml-352-823.html | Dextran-supplemented organ culture medium used for deturgescence |
Fiji (ImageJ) | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | https://fiji.sc/ | Open source image processing software |
Matlab | Mathworks, Inc., Natick, MA, USA | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | Mathematical computing software |