Approche en deux étapes pour explorer et fin-début de la Formation des organes dans le modèle aviaire : le Thymus et des glandes parathyroïdes organogenèse paradigme
Summary
Cet article fournit une approche de mise à jour du système classique caille-poulet chimère pour étudier la formation des organes, en combinant les nouvelles procédures expérimentales in vitro et in ovo .
Abstract
L’embryon aviaire, comme modèle expérimental, a été primordial pour séminales découvertes en biologie du développement. Parmi plusieurs approches, la formation des chimères de caille-poulet et l’utilisation de la membrane chorio-(CAM) pour soutenir le développement de tissus ectopiques remontent au siècle dernier. De nos jours, la combinaison de ces techniques classiques avec des méthodologies récentes in vitro offre des perspectives nouvelles pour explorer davantage la formation des organes.
Nous décrivons ici une approche en deux étapes afin d’étudier et de tard-début de l’organogenèse. Brièvement, la région embryonnaire contenant le territoire présomptif de l’orgue est isolée à partir d’embryons de caille et cultivés in vitro dans un système organotypique (jusqu’à 48 h). Des tissus cultivés sont ensuite greffées sur la CAM d’un embryon de poulet. Après 10 jours en ovo développement, organes entièrement formées sont obtenus à partir des tissus greffés. Cette méthode permet également la modulation des voies de signalisation par l’administration régulière d’agents pharmacologiques et manipulation génétique des tissus tout au long des étapes du développement in vitro et in ovo . En outre, des tissus peuvent être collectées à toute fenêtre de temps pour analyser leur profil d’expression génétique (à l’aide de la PCR quantitative (qPCR), puces, etc.) et leur morphologie (évalué avec immunochimie et histologie conventionnelle).
La procédure expérimentale décrite peut servir comme un outil pour suivre la formation des organes à l’extérieur de l’embryon aviaire, depuis le début de l’organogenèse entièrement formé et les organes fonctionnels.
Introduction
Embryons aviaires ont été largement utilisées dans les études de biologie du développement séminal. Les principaux avantages du modèle aviaire incluent la possibilité d’ouvrir le œuf, l’accès relativement facile à l’embryon et la capacité d’exécuter micromanipulation. Quelques exemples comprennent le système classique caille-poulet chimère pour l’étude des cellules sort1, application des facteurs de croissance spécifiques à l’ embryon2et la croissance des structures cellulaires ectopiques dans le CAM1,3, 4.
Pour obtenir de nouvelles connaissances en étapes distinctes de la formation des organes, nous avons récemment mis au point une méthode qui combine les techniques de greffage avec in vitro la manipulation des tissus embryonnaires5. L’approche en deux étapes permet à la discrimination et l’exploration de deux et fin-début de l’organogenèse, qui sont souvent limités en raison des tissus hautement dynamique et complexe des interactions2. En outre, l’absence de marqueurs de tissu-spécifique adaptés limite souvent l’utilisation de génétiquement modifiés6de modèles animaux. Cette nouvelle méthode de l’approche en deux étapes surmonte largement ces limites.
Pour étudier le début de la formation des organes, dans la première étape, territoire embryonnaire caille comprenant le rudiment de l’éventuel organe est isolé et cultivé dans un système in vitro organotypique pendant 48 h. Durant cette période, la modulation pharmacologique des voies de signalisation spécifiques peut être effectuée en ajoutant des drogues dans le milieu de culture5,7. En outre, des tissus cultivés soient collectées à tous les stades de la croissance in vitro et sondés pour expression génétique (à l’aide de méthodes telles que qPCR, puces, etc.).
Dans la deuxième étape, les 48 h-cultivées tissus sont ensuite greffées sur la CAM d’un embryon de poulet (c) à jour embryonnaire (E) 8 (cE8) (Hamburger et Hamilton (HH)-met en scène 33-35)8. La came se comporte comme un fournisseur vasculaire de nutriments et permet aux gaz échanges1,3,4 tissus greffés permettant son développement en ovo pour des périodes plus longues. Cette étape expérimentale est particulièrement bien adaptée pour étudier les derniers stades de l’organogenèse, comme organes entièrement formées peuvent être obtenus après 10 jours de ovo développement5,9,10,11 . Analyse morphologique est facilement réalisée par histologie conventionnelle pour confirmer la formation des organes appropriés et origine donneur de cellules peut être identifié par immunohistochimie à l’aide d’anticorps spécifiques d’espèce (c.-à-d., MAb caille périnucléaire (QCPN)). Au cours de la période d’incubation de CAM, greffes peuvent être également cultivés en présence d’agents pharmacologiques et recueillies à n’importe quel stade de développement pour évaluer la progression de l’organogenèse.
L’approche en deux étapes, décrit ici en profondeur, a déjà travaillé en Figueiredo et al. 5 d’envisager l’élaboration de primordium commun aviaire parathyroïde/thymus. En conséquence, les particularités inhérentes des territoires embryonnaires et stades de développement impliqué dans l’organogénèse du thymus et des glandes parathyroïdes seront présentés ci-dessous.
Le thymus et l’épithélium des glandes parathyroïdes, bien que fonctionnellement distinctes, dérive de l’endoderme des sachets pharyngées (PP)12. Aviaire, l’épithélium des ces organes sont originaires de la troisième et quatrième PP endoderme (3/4PP)12, tandis que chez les mammifères l’épithélium thymique dérive de la 3PP et l’épithélium des glandes parathyroïdes dérive de la 3PP et 3/4PP en souris et humains, respectivement13,14.
Une des premières étapes dans la formation de ces organes est l’émergence du thymus discrète et domaines parathyroïdiennes dans le primordium commun. Dans le poulet, ces domaines peuvent être identifiés par hybridation in situ , avec des marqueurs moléculaires spécifiques, à E4.515. Comme développement produit, ces rudiments d’orgue individualiser et séparent du pharynx, alors qu’une mince capsule mésenchymateuse, formée par des cellules neurales de crête, qui les entoure (à E5 ; 27 HH-stage). Plus tard, on l’épithélium thymique est colonisé par des cellules progénitrices hématopoïétiques (à E6.5 ; HH-stage 30)12.
Comme dans les études de caille-poulet classiques1,12, l’approche en deux étapes est particulièrement utile pour étudier la formation des organes hématopoïétiques/lymphoïdes, à savoir le thymus5. Comme la caille explantation, avec le rudiment de l’orgue, est greffée dans l’embryon de poulet avant la colonisation des cellules progénitrices hématopoïétiques, un thymus chimérique est formé avec poulet hématogène progéniteurs infiltrer un homologue épithéliales thymiques caille. Cette méthode est, par conséquent, un outil utile pour étudier la contribution des cellules hématopoïétiques dans le développement du système lymphoïde/hémato aviaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un aspect crucial pour le succès de cette méthode est la qualité de la caille et de poulet oeufs. Étant donné que les périodes d’incubation longue, particulièrement au cours de l’essai in ovo , une bonne qualité des œufs de poule améliore la viabilité tarifs (jusqu’à 90 %) à la fin de la procédure. Pour ce faire, tester les oeufs provenant de fournisseurs différents. Incuber les œufs non manipulés pendant de longues périodes (jusqu’à 16-17 jours) et contrôler leur développement. Pour êt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs sont reconnaissants envers António Cidadão, Isabel Alcobia et Leonor Parreira pour la lecture critique du manuscrit, à Padma Akkapeddi pour la narration vidéo, et de Vitor Proa auprès du Service d’histologie de l’Instituto de Histologia e Biologia do Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, pour le support technique. Nous sommes particulièrement redevables à Paulo Caeiro et Hugo Silva de l’Unidade de audiovisuais (unité de l’audiovisuel), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa pour leur engagement exceptionnel en faveur de la production de cette vidéo. Nous reconnaissons Leica Microsystems pour aimablement un stéréoscope équipé de système vidéo et de Interaves – Sociedade Agro-Pecuária, S.A de contribuer avec caille fécondés. Ce travail a été soutenu par Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).
Materials
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Polycarbonate Membrane Insert | Corning | 3412 | 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| 6-well culture plates | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Pyrex bowls | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | normax | 5426015 | |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Filter paper |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Cyclopamine hydrate | Sigma-Aldrich | C4116 | Pharmacological inhibitor of Hh signalling |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Pharmacological inhibitor of Notch signalling |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Reagent for total RNA isolation |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 |
References
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