2 단계 접근-그리고 늦은-초기 조류 모델에서 기관 형성의 탐구: Thymus 및 부 갑 상선 동맥 Organogenesis 패러다임
Summary
이 문서에서는 소설 비켜 및 생체 외에서 실험 절차를 결합 하 여 기관 형성, 공부 클래식 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템 업데이트 접근 합니다.
Abstract
조류 배아 실험 모델로 되었습니다 정액 발견에 대 한 매우 중요 개발 생물학. 중 몇 가지 방법을, 메 추 라 기-닭고기 키메라의 형성 및 chorioallantoic 막 (CAM) 소성 조직 날짜 지난 세기에 개발을 유지 하기 위해 사용. 요즘, 최근 생체 외에서 방법론으로 이러한 고전적인 기술 조합 추가 기관 형성을 찾아보기 새로운 잠재 고객을 제공 합니다.
여기-그리고 늦은-초기 organogenesis의 공부 하는 2 단계 접근 방식을 설명 합니다. 간단히, 배아 지역 기관의 추정 영토를 포함 하는 (48 h) 최대 organotypic 시스템에서 메 추 라 기 태아와 성장 생체 외에서 격리 됩니다. 교양된 조직 이후 닭 배아의 캠에 융합 된다. 비켜에 개발의 10 일 후 완전히 형성된 장기 이식할된 조직에서 얻을 수 있습니다. 이 메서드는 또한 약리 에이전트의 일반 행정과 조직 체 외 고 비켜 발달 단계에 걸쳐 유전자 조작에 의해 경로 신호 변조를 수 있습니다. 또한, 조직 개발 그들의 유전자 발현 프로 파일 (를 사용 하 여 정량 PCR (정량), microarrays, 등) 및 형태 (전통적인 조직학 및 immunochemistry 평가) 분석을 어떤 시간대에 수집할 수 있습니다.
설명된 실험 절차를 따라 완벽 하 게 형성 하는 organogenesis의 초기 단계에서 기능적 장기 조류 배아 외부 기관 형성 도구로 사용할 수 있습니다.
Introduction
조류 배아 정액 발달 생물학 연구에서 널리 사용 되었습니다. 새 모델의 주요 장점은 오픈 계란, 태아, 그리고 micromanipulation를 수행 하는 능력에 상대적으로 쉽게 접근할 수를 포함 합니다. 세포 운명1, 배아2, 특정 성장 요인의 응용 프로그램 및 캠1,3, 소성 세포 구조의 성장 공부에 대 한 고전적인 메 추 라 기-치킨 키메라 시스템을 구성 하는 몇 가지 예 4.
기관 대형의 다른 단계에 대 한 새로운 통찰력을 얻으려면, 우리는 최근 체 외에서 배아 조직5의 조작으로 이식 기법을 결합 하는 방법을 개발 했습니다. 2 단계 접근 차별 및 탐사의 두 초기-및-의 후기 organogenesis는 매우 역동적이 고 복잡 한 조직 상호 작용2인해 제한 수 있습니다. 또한, 적합 한 조직 관련 마커의 부족 자주 제한의 사용 유전자 변형 동물 모델6. 2 단계 접근의이 새로운 방법은 크게 이러한 한계를 극복 한다.
첫 번째 단계에서 기관 형성의 초기 단계를 공부 하 메 추리 배아 영토 잠재 기관 rudiment 구성 된 절연 이며 48 h에 대 한 생체 외에서 organotypic 시스템에서 성장. 이 기간 동안, 특정 신호 통로의 약리 변조 배양5,7약물을 추가 하 여 수행할 수 있습니다. 또한, 교양된 조직 생체 외에서 성장의 모든 단계에서 수집 된 수 있습니다 하 고 유전자 발현에 대 한 조사 (정량, microarrays, 등등과 같은 메서드를 사용 하 여).
두 번째 단계에서 48 h 교양 조직 다음 닭 (c) 배아 배아 날 (E) 8 (cE8)의 캠에 융합은 (햄버거와 해밀턴 (HH)-33-35 단계)8. 캠은 영양분의 혈관 공급 동작 고 가스 교류1,,34 이식할된 조직을 그것의 개발에서 비켜에서 오랜 시간에 대 한 사용을 허용 한다. 이 실험 단계는 특히 적합 organogenesis의 늦은 단계 공부로 비켜 개발5,,910,11의 10 일 후 완전히 형성된 장기를 얻을 수 있습니다. . 형태소 분석은 쉽게 적절 한 기관 형성을 확인 하기 위해 전통적인 조직학 수행 하며 세포의 기증자 기원 immunohistochemistry 종의 항 체 (즉, MAb 메 PeriNuclear (QCPN))를 사용 하 여 확인할 수 있습니다. 캠 잠복기 동안 이식 또한 수 약리학 대리인의 면 전에 서 성장 하 고 organogenesis의 진행을 평가 하는 개발의 모든 단계에서 수집 된.
깊이, 여기에 설명 된 2 단계 접근 방식은 이미 Figueiredo 외 에 고용 되어 조류 부 갑 상선/thymus 일반적인 primordium 개발 탐험 5 . 따라서, 배아 영토의 고유의 특성 및 thymus의 부 갑 상선 동맥은 organogenesis에 관련 된 개발의 단계 아래에 표시 됩니다.
Thymus 및 부 갑 상선 동맥 epithelia, 하지만 기능적으로 고유에서 파생 pharyngeal 주머니의 endoderm (PP)12. 조류, 이러한 장기의 epithelia에서에서 발생 한 제 3의 그리고 제 4 PP endoderm (3/4PP)12, 포유류에서 thymic 상피는 3PP에서 파생 하 고 부 갑 상선 땀 샘의 상피 3PP 3/4PP 마우스에서와 인간에서 파생 하는 동안 각각13,은14입니다.
이러한 장기의 형성에서 초기 단계 중 개별 thymus 및 일반적인 primordium에서 부 갑 상선 도메인의 출현 이다. 치킨, E4.515에서 특정 분자 마커와 제자리에서 교 잡 하 여 이러한 도메인을 확인할 수 있습니다. 개발 진행, 이러한 장기 초보 개별화 하 고 신경 크레스트 파생 된 세포에 의해 형성 된 얇은 엽 캡슐 (E5;에서 그들을 포위 하는 동안에 인 두에서 분리 HH-stage 27). Thymic 상피 조상 조 혈 모 세포 (E6.5;에 의해 식민지는 나중에, HH-stage 30)12.
클래식 메 추 라 기-치킨 연구1,12에서 2 단계 접근 림프/조 혈 기관, 즉 thymus5의 형성 연구에 특히 유용 하다. 메 추 라 기는 explant, 기관 rudiment와 서 투입은 조 혈 조상 세포 식민 이전 닭 배아, 공상 thymus 메 thymic 상피 대응 침투 닭 혈액을 매개로 조상 세포로 형성 된다. 이 방법은, 따라서 조류 hemato/림프 시스템의 개발에 조 혈 모 세포의 기여를 탐험 하는 유용한 도구입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 방법의 성공에 대 한 중요 한 측면은 품질 닭고기와 메 추 라 기의 달걀. 고려는 긴 부 화 기간, 특히 에 비켜 분석 결과, 계란의 좋은 품질 향상 생존 프로시저의 끝으로 (최대 90%까지) 요금. 이를 위해, 다른 공급 업체에서 계란을 테스트 합니다. 오랜 기간 동안 unmanipulated 알을 품 어 (최대 16-17 일) 그들의 발달을 체크 하 고. 좋은 품질의 일괄 처리로 간주, 배아의 80% 이상이 정상적인 발전…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 원고, Padma Akkapeddi 비디오 나레이션 대 하의 중요 한 독서에 대 한 안토니오 Cidadão, 이사벨 Alcobia, 레오노르 Parreira를 감사 고 Instituto de Histologia 전자의 조직학 서비스에서 Vitor 쾌속 범선을 Biologia Desenvolvimento, Faculdade de Medicina 드 리스보아, Universidade 드 리스보아, 기술 지원에 대 한. 우리는 특히 파울로 카에 이루와 휴고 실바 Unidade 드 audiovisuais (시청각 단위), Faculdade 데에서에서 빚을 Medicina 드 리스보아,이 비디오의 생산에 그들의 뛰어난 노력에 대 한 Universidade 드 리스보아. 우리는 친절 하 게 제공 stereoscope Interaves 비디오 시스템을 장착 하기 위한 Leica 마이크로 시스템즈 인정-계란을 기름 지 게 하 고 있다 농업-Pecuária, 메 추 라 기와 기여에 대 한 활발. 이 작품은 Faculdade 드에 의해 지원 되었다 Medicina 드 리스보아, Universidade 드 리스보아 (FMUL).
Materials
| Chicken fertilized eggs (Gallus gallus) | Pintobar, Portugal | Poultry farm | |
| Quail fertilized eggs (Coturnix coturnix) | Interaves, Portugal | Bird farm | |
| 15 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL PP centrifuge tubes | Corning | 430290 | |
| 60 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 41 | |
| 100 x 20 mm pyrex dishes | Duran group | 21 755 48 | |
| Polycarbonate Membrane Insert | Corning | 3412 | 24 mm transwell with 0.4 mm Pore Polycarbonate Membrane Insert |
| Membrane filter | Millipore | DTTP01300 | 0.6 mm Isopore membrane filter |
| 6-well culture plates | Nunc, Thermo Fisher Scientific | 140675 | |
| Petri dish, 35 x 10 mm | Sigma-Aldrich | P5112 | |
| Pyrex bowls | from supermarket | ||
| Transfer pipettes | Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific | 2041S | 2 mL plastic pipet |
| Glass pasteur pipette | normax | 5426015 | |
| Whatman qualitative filter paper | Sigma-Aldrich | WHA1001090 | Filter paper |
| Clear plastic tape | from supermarket | ||
| Cytokeratin (pan; acidic and basic, type I and II cytokeratins), clone Lu-5 | BMA Biomedicals | T-1302 | |
| Cyclopamine hydrate | Sigma-Aldrich | C4116 | Pharmacological inhibitor of Hh signalling |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Standart FBS | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | QCPN | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | GIBCO, Thermo Fisher Scientific | 61870010 | |
| Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit | ELKEM/Silmid | RH141001KG | To prepare the back base for petri dish |
| Stemolecule LY411575 | Stemgent | 04-0054 | Pharmacological inhibitor of Notch signalling |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Reagent for total RNA isolation |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | Thin forceps |
| Extra fine Bonn scissors, curved | Fine Science Tools | 14085-08 | Curved scissors |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26001-30 | |
| Micro spatula | Fine Science Tools | 10087-12 | Transplantation spoon |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | Microscalpel |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Holder |
| Moria Perforated Spoon | Fine Science Tools | 10370-17 | Skimmer |
| Wecker Eye Scissor | Fine Science Tools | 15010-11 | |
| Camera | Leica Microsystems | MC170 HD | |
| Stereoscope | Leica Microsystems | Leica M80 | |
| Microscope | Leica Microsystems | DM2500 |
References
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