针对天然产物的单克隆抗体的产生
Summary
本文提供了一个详细的方案, 用于制备和评价用于各种免疫检测的天然产品单克隆抗体。该程序包括免疫接种、细胞融合、用于阳性克隆筛选的间接竞争性 ELISA 和单克隆杂交瘤制剂。还提供了使用 maldi TOF-MS 和 ELISA 分析进行抗体表征的规范。
Abstract
对食品和天然产品中存在的生物活性成分的分析已成为中医药、食品安全毒理学等多个领域的热门研究领域。许多经典的分析技术需要昂贵的设备和专业知识。值得注意的是, 酶联免疫吸附法 (Elissa) 已成为分析食品和天然产品的一种新方法。该方法基于抗体介导的目标成分检测。然而, 由于天然产品中的许多生物活性成分很小 (和 lt;1,000 的含量), 不会诱发免疫反应, 因此对其产生单克隆抗体往往很困难。在本协议中, 我们详细解释了针对目标分子生成 mAbs 所需的步骤, 以及创建相关的间接竞争 (ic) ELISA 以快速分析多个样品中的化合物所需的步骤。该程序描述了人工抗原 (即, 随体共轭) 的合成、免疫、细胞融合、单克隆杂交瘤制剂、mab 的表征以及 mab 的基于 elisa 的应用。采用钠周期法合成了伴随载体共轭, 并用 aldi TOF-MS 进行了评价。免疫后, 用聚乙二醇 (peg) 基方法从抗体滴度最高的免疫小鼠中分离出脾细胞, 并与低黄嘌呤-氨基铂-胸苷 (HAT) 敏感的小鼠骨髓瘤细胞系 Sp2/0-ag14 熔融。用 icELISA 对对靶抗原进行了 Mabs 反应性的杂交瘤的特异性和交叉反应性筛选。此外, 还采用极限稀释法制备单克隆杂交瘤。最后的 mAbs 进一步被特征的 icELISA, 然后在 elisa 为基础的应用程序中用于快速和方便地检测示例阿平 (naringin (NAR)) 在自然产品中。
Introduction
单克隆抗体 (mAbs), 也称为单特异性抗体, 由单个 b 淋巴细胞克隆产生, 由单卵形抗体组成, 所有抗体都与同一表位1结合。近年来, 许多药用植物衍生的天然产品被用于各种疾病的治疗.事实上, 许多最初从天然产物中提取的小分子化合物现在被用作一线药物, 如疟疾青蒿素和 2,3种癌症的紫杉醇 (紫杉醇)。天然产物的研究取得了较快的进展, 这在很大程度上是由于传统分析技术的巨大发展和优化, 包括高效液相色谱 (HPLC) 和质谱 (MS)。然而, 这些方法仍然存在一些限制, 例如其复杂的预处理方案以及在时间、劳动力专门知识和所需文书方面的相关费用4。
近年来, 基于 mabs 的酶联免疫吸附法 (Elissa) 已被应用于食品和天然产物的定性和定量分析。事实上, 这种方法已被应用于生物样品分析和临床试验, 并已被证明是准确的, 敏感的, 高效的, 同时也避免了繁琐的预处理步骤与其他分析 5, 6。
当使用基于 mabs 的 Elisa 研究复杂的天然产物时, 单克隆抗体的制备是核心步骤之一。不幸的是, 这些类型的物质中存在的小生物活性成分的mabs6、7、8、9、10、11、12与蛋白质抗原相比,13、14、15 通常是有限的。为了规避这个问题, 我们开发了一个协议, 专门生成针对小化合物的 mAbs。这里介绍的方案包括人工抗原合成、小鼠免疫接种、细胞融合、间接竞争 ELISA 和单克隆杂交瘤制剂。
值得注意的是, 我们的研究小组多年来一直在研究针对中药中的小生物活性化合物形成 mAbs 的问题, 并开发其应用。在我们正在进行的研究中, 我们开发了针对黄芪苷 16、葛根素 17、甘草酸18、paeoniflorin19、人参皂苷 re 20、人参皂苷 Rh1 等许多小分子的 mabs.我们基于这些 mAbs 的 ELISA 协议已被用于许多研究, 以评估这些小分子的药代动力学及其与其他生物活性化合物的相互作用。此外, 利用这些 mAbs, 我们还开发了免疫亲和层析方法来分离结构类似物, 包括表皮。最近, 我们准备了一个侧流免疫分析使用我们的抗葛根素 mAb, 随后用于快速, 现场检测这种化合物。我们的研究结果表明, 我们基于 mabs 的检测方法对于研究天然产品衍生化合物的生物学和质量, 特别是中药中使用的化合物的生物学和质量, 是不可或缺的、方便的工具。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里, 我们提出了一个协议, 成功地生产 mAbs 对天然产品衍生的小分子。该过程中的基本步骤已经概述, 我们已经证明了这个协议的效用使用 NAR 作为一个例子小分子。实例谱、反应性分析和 icELISA 结果均显示了该协议获得的具有代表性的实验和控制数据。杂交瘤的示例图像提供了研究人员在区分单克隆和多克隆杂交圆顶时应该寻找的内容的视觉表示。总之, 我们已经证明, 这里介绍的 mAb 生产、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家自然科学基金 (赠款编号81573573、81573573和 81503344) 和北京中医药大学经典处方基础研究小组的支持。
Materials
| 800 mesh (40 μm nylon) filter | FALCON | 352340 | |
| 24 well culture plate | NUNC | 119567 | |
| 25 cm2 Flask | Labserv | 310109016 | |
| 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine(TMB) | Sigma Aldrich | 860336 1G | |
| 75 cm2 Flask | Corning | 430720 | |
| 96 well culture plate | NUNC | 117246 | |
| bovine serum albumin | AMRESCO | 332 | |
| cell strainer | FALCON | 352340 | |
| centrifuge tube 15 mL | Corning | 430645 | |
| centrifuge tube 50 mL | Corning | 430828 | |
| cryotubes, 1 mL | Sigma Aldrich | V7384-1CS | |
| cultivator | DRP-9082 | Samsung | |
| dialysis membrane (10kDa) | Heng Hui | 45-10000D | |
| dimethylsulfoxide | Sinopharm Chemical | DH105-10 | |
| electronic balance | BS124-S | Sartorius | |
| ELISA plates, 96 well | NUNC | 655101 | |
| ethanol, 96% | Sinopharm Chemical | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| fetal calf serum | Invitrogen | 10270106 | |
| Freund´s adjuvant, complete | Sigma Aldrich | SLBM2183V | |
| Freund´s adjuvant, incomplete | Sigma Aldrich | SLBL0210V | |
| Gelatin | AMRESCO | 9764-500g | |
| Gradient cooler container | Nalgene | 5100-0001 | |
| HAT media supplement | Sigma Aldrich | H0262-10VL | |
| HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody | applygen | C1308 | |
| HT media supplement | Sigma Aldrich | H0137-10VL | |
| Inverted Microscope | IX73 | Olympus | |
| keyhole limpet hemocyanin | Sigma Aldrich | H8283 | |
| MALDI-TOF-MS | Axima-CFR plus | Axima | |
| Microplate Reader | BioTex | ELX-800 | |
| mouse | Vital River | BALB/c | |
| ovalbumin | Beijing BIODEE | 5008-25g | |
| PEG | Sigma Aldrich | RNBC6325 | |
| Penicillin&Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | |
| Pipette 10 mL | COSTAR | 4488 | |
| Pipette 25 mL | FALCON | 357525 | |
| RPMI 1640 | Corning | 10-040-CVR | |
| skim milk | applygen | P1622 | |
| sodium periodate | Sinopharm Chemical | BW-G0008 | |
| Sulfo-GMBS | Perbio Science Germany | 22324 | |
| TipOne Tips 1,000 µL | Starlab | S1111-2021 |
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