Bemühungen, Mikroglia-Funktion im Detail zu verstehen haben durch das Fehlen von Mikroglia Kultur Modelle behindert worden, die die Eigenschaften der Reifen in Vivo Mikroglia rekapitulieren. Dieses Protokoll beschreibt einen Isolation und Kultur Ansatz entwickelt, um robuste überleben stark verzweigten Reife Ratte Mikroglia Bedingungen definiert-Mittel zu erhalten.
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Methodenartikel
Isolation und Kultur von Nagetier Microglia zur Förderung einer dynamisches verzweigt Morphologie in serumfreien Medium
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mikroglia repräsentieren ca. 5-10 % aller Zellen des zentralen Nervensystems (ZNS) und sind immer mehr Aufmerksamkeit durch ihre Beiträge während der Entwicklung, Homöostase und Krankheit. Obwohl Makrophagen im Detail für Jahrzehnte, spezielle Funktionen der Mikroglia, die Gewebe-Bewohner Makrophagen des ZNS untersucht wurden, blieben weitgehend geheimnisvoll, teilweise aufgrund von Einschränkungen in der Fähigkeit, Reife Mikroglia rekapitulieren Unterkünfte in Kultur. Hier zeigen wir ein einfaches Verfahren für die schnelle Lokalisierung der reinen Mikroglia aus dem Reifen Nagetier Gehirn. Wir beschreiben auch serumfreien Kulturbedingungen, die hohe Rentabilität der Mikroglia im Laufe der Zeit unterstützen. Mikroglia, die unter diesen Bedingungen definiert-Medium kultiviert weisen aufwändige verzweigte Prozesse und dynamische Überwachung Verhalten. Wir veranschaulichen einige Auswirkungen der Serum-Exposition auf kultivierten Mikroglia und besprechen, wie diese serumfreien Kulturen im Vergleich zu Serum-exponierten Kulturen sowie Mikroglia in Vivo.
Einleitung
Als Makrophagen CNS Parenchym Mikroglia interagieren mit einer Vielzahl von neuronalen Schaltkreise und Glia Signalisierung Netzwerke. Sie spielen eine entscheidende Rolle in der Entwicklung und Homöostase des Gehirns durch synaptische Rebschnitt, apoptotische Zelle Abfertigung und transiente Interaktionen mit neuronalen Prozessen1,2. Mikroglia sind frühe Responder zu neurologischen Verletzungen, erweitern ihre langen, dünnen Prozesse Läsionsorte zu Entzündungsreaktionen zu koordinieren und Blutungen3,4zu begrenzen. Veränderungen in der Mikroglia Morph....
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Protokoll
Alle Verfahren, die Nagetiere entsprach Stanford University Richtlinien, welche nationalen und staatlichen Gesetze und Richtlinien einhalten. Stanford University Verwaltungs-Panel auf Laboratory Animal Care stimmten alle tierische Verfahren.
Hinweis: Alle Lösung und Puffer Kompositionen sind in der Tabelle der Materialienzur Verfügung gestellt.
1. bereiten Sie eine Petrischale für CD11b Immunopanning (Tag 0)
Hinweis: Bereiten Sie 1 Immunopanning Gericht für jeden 1-2 juvenile Ratten Gehirne.
- Eine 15 cm Petrischale 25 mL 50 mm Tris pH 9.5 Lösung hinzufügen.
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Ergebnisse
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Kultur hochreine verzweigt Mikroglia von jungen Ratten. Ähnliche Ergebnisse können mit unreifen, perinatale und Erwachsene Tiere, wie weiter unten besprochen. Da Zelle Isolationen oft beinhalten subtilen Nuancen und viele Möglichkeiten für Zellen sterben verwendet wir Qualitätskontrolle Kontrollpunkte um Erfolg in verschiedenen Schritten zu ermitteln. Wir überwacht in der Regel Zellsuspensionen mit einer Hemocytometer in mehreren Schritten in d.......
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Diskussion
Da Mikroglia als Sentinel immunen Zellen des ZNS dienen, sind sie sehr ansprechend auf Veränderungen der Umwelt; Daher ist großer Sorgfalt erforderlich, um entzündliche Reaktionen in den Zellen während ihrer Isolation und Kultur8zu minimieren. Dies geschieht in diesem Protokoll durch Geschwindigkeit und Temperatur. Die Zellen auf Eis oder bei 4 ° C zu halten, wann immer möglich Aktivierung, reduziert so dass alle Schritte der Zentrifugation bei 4 ° C erfolgen, die Tiere sind mit eiskalten Perfusio.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass die Forschung in der Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen geführt wurde, die als ein potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnte.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von Christopher und Dana Reeve Foundation International Research Consortium auf Verletzungen des Rückenmarks, Dr. Miriam und Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation, der Stiftung JPB Novartis Institute der Grundlagenforschung unterstützt, großzügige Beiträge von Vincent und Stella Coates und Damon Runyon Cancer Research Foundation (DRG-2125-12).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Ratte: Sprague-Dawley | Charles River | Cat# 400 | |
| Maus Anti-Ratte CD11b monoklonal (Klon OX42) | Bio-Rad | Cat# MCA275R | Panning: 1:1.000; Färbung: 1:500 |
| Ziege polykolonal anti-Iba1 | Abcam | Cat# AB5076 | Färbung: 1:500 |
| Kaninchen polyklonal anti-Ki67 | Abcam | Cat# AB15580 | Färbung: 1:500 |
| Alexa Fluor Esel anti-maus 594 | Invitrogen | Cat# 11055 | Färbung: 1:500 |
| Alexa Fluor Esel anti-Ziege 488 | Invitrogen | Cat# A-21203 | Färbung: 1:500 |
| Alexa Fluor Donkey Anti-Rabbit 647 | Invitrogen | Cat# A-31573 | Färbung: 1:500 |
| Triton-X (Reinigungsmittel in ICC-Färbung) | Thermo Fisher | Cat# 28313 | |
| Heparansulfat | Galen Laborbedarf | Cat# GAG-HS01 | |
| Heparin | Sigma | Cat# M3149 | |
| Pepton aus Milchfeststoffen | Sigma | Cat# P6838 | |
| TGF-β 2 | Peprotech | Cat# 100-35B | |
| Murine IL-34 | R& D Systems | Cat# 5195-ML/CF | |
| Schafwolle Cholesterin | Avanti Polar Lipids | Cat# 700000P | |
| Kollagen IV | Corning | Kat# 354233 | |
| Ölsäure | Cayman Chemicals | Kat# 90260 | |
| 11(Z)Eicosadienoic (Gondoin) Acid | Cayman Chemicals | Cat# 20606 | |
| Calcein AM Farbstoff | Invitrogen | Cat# C3100MP | |
| Ethidium Homodimer-1 | Invitrogen | Cat# E1169 | |
| DNaseI | Worthington | Cat# DPRFS | |
| Percoll PLUS | GE Healthcare | Cat# 17-5445-02 | |
| Trypsin | Sigma | Cat# T9935 | |
| DMEM/F12 | Gibco | Kat# 21041-02 | |
| Penicillin/ Streptomycin | Gibco | Katze # 15140-122 | |
| Glutamin | Gibco | Katze # 25030-081 | |
| N-Acetylcystein & nbsp; | Sigma | Cat# A9165 | |
| Insulin | Sigma | Cat# 16634 | |
| Apo-Transferrin | Sigma | Cat# T1147 | |
| Natriumselenit | Sigma | Cat# S-5261 | |
| DMEM (hoher Glukosegehalt) | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dapi Fluoromount-G | Southern Biotech | Cat# 0100-20 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma | Cat# A-003-E | |
| Primärplatten | VWR | Cat# 62406-456 | |
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
| Lagerreagenzien | |||
| : 10 mg/ml in PBS Verwendete Konzentration: 1:100 Lagerung: -20 μm; C | |||
| N-Acetylcystein | Rekonstitution: 5 mg/ml in H2O Verwendete Konzentration: 1:1.000 Lagerung: -20 μm; C | ||
| Natriumselenit | Rekonstitution: 2,5 mg/ml in H2O Verwendete Konzentration: 1:25.000 Lagerung: -20 μm; C | ||
| Kollagen IV | Rekonstitution: 200 μ g/ml in PBS Verwendete Konzentration: 1:100 Lagerung: -80 μm; C | ||
| TGF-b2 | Rekonstitution: 2 mg/ml in PBS Verwendete Konzentration: 1:1.000 Lagerung: -20 μm; C | ||
| IL-34 | Rekonstitution: 200 μmu; g/ml in PBS Verwendete Konzentration: 1:1.000 Lagerung: -80 μm; C | ||
| Schafwolle | : 1,5 mg/ml in 100 % Ethanol Verwendete Konzentration: 1:1.000 Lagerung: -20 μm; C | ||
| Heparansulfat-Rekonstitution | : 1 mg/ml in H2O Verwendete Konzentration: 1:1.000 Lagerung: -20 μm; C | ||
| Ölsäure/Gondoinsäure | Rekonstitution: Gondoinsäure: 0,001 mg/ml; Ölsäure: 0,1 mg/ml in 100 % Ethanol Verwendete Konzentration: 1:1.000 Lagerung: -20 μm; C | ||
| : 50 mg/ml in PBS Verwendete Konzentration: 1:100 Lagerung: -20 μm; C | |||
| Name | Unternehmen | Katalognummer< | strong>Kommentare |
| Lösungen Perfusionspuffer | |||
| Rezept: 50 μ g/mL Heparin in DPBS++ (PBS mit Ca++ und Mg+ +) Kommentare: Bei eiskalter | |||
| Verwendung Douncing Buffer | Rezept: 200 μ L von 0,4% DNaseI in 50 mL DPBS++ Bemerkungen: Bei eiskaltem | ||
| Panning Buffer | verwenden Rezept: 2 mg/mL Pepton aus Milchfeststoffen in DPBS++ | ||
| Microglia Growth Medium (MGM) | Rezept: DMEM/F12 mit 100 Einheiten/mL Penicillin, 100 μ g/mL Streptomycin, 2 mM Glutamin, 5 μ g/mL N-Acetylcystein, 5 μ g/ml Insulin, 100 μ g/mL Apo-Transferrin und 100 ng/ml Natriumselenit Kommentare: Verwenden Sie eiskaltes MGM, um Mikroglia von der Immnopanning-Schale abzufüllen. | ||
| Kollagen IV Überzugsrezept | : MGM mit 2 μ; g/mL Kollagen IV | ||
| Myelin Seperation Buffer | Rezept: 9 mL Percoll PLUS, 1 mL 10x PBS ohne Ca++ und Mg++, 9 μ L 1 M CaCl2, 5 μ L 1 M MgCl2 Kommentare: Nach der Zugabe von CaCl2 und MgCl2 | ||
| TGF-b2/IL-34/Cholesterin enthaltende Wachstumsmedien (TIC) | Rezept: MGM mit humanem 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murinem IL-34, 1,5 μ g/mL Cholesterin aus Schafwolle, 10 μ g/mL Heparansulfat, 0,1 μ g/ml Ölsäure und 0,001 μ g/ml Gondoinsäure Kommentare: Achten Sie darauf, Cholesterin in Medien zu geben, die auf 37 μg erwärmt sind; C und fügen Sie nicht mehr als 1,5 μm hinzu. g/mL oder es fällt aus. Filtern Sie keine cholesterinhaltigen Medien. Äquilibrieren Sie TIC-Medien 30 Minuten bis 1 Stunde lang mit 10 % CO2, bevor Sie sie den Zellen hinzufügen, um einen optimalen pH-Wert zu gewährleisten. |
Referenzen
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia Function in the Central Nervous System During Health and Neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).
- Wu, Y., Dissing-Olesen, L., MacVicar, B. A., Stevens, B. Microglia: Dynamic Mediators of Synapse Development ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
