本文描述的协议是一种测量马铃薯块茎内 endoreduplication 的方法 (马铃薯)。它包括质壁分离和原生质体提取步骤, 以减少下游流细胞分析中的噪声和碎片。
Endoreduplication, 复制细胞的核基因组没有随后的胞质分裂, 产生细胞的 DNA 含量增加, 并与专业化, 发展和细胞大小的增加有关。在植物中, endoreduplication 似乎促进了某些组织和器官的生长和扩展。其中包括马铃薯块茎 (马铃薯), 它在履行碳水化合物储存功能方面经历了相当大的细胞扩张。因此, endoreduplication 可以发挥重要作用, 块茎如何能够容纳这种丰富的碳。然而, 由于块茎的粗核分离方法所产生的细胞碎片, 可以有效地用于叶子的方法, 排除了对块茎 endoreduplication 指数 (EI) 的估计。本文提出了一种通过分离原生质体来评估块茎 endoreduplication 的技术, 同时证明了不同基因型和分离块茎组织的代表性结果。该协议的主要局限性是样品制备所需的时间和试剂成本, 以及在原生质体溶解后样品的寿命相对较短。虽然该议定书对技术变化很敏感, 但它代表了从这些大型专门细胞中分离出的传统核隔离方法的改进。提出了改进《议定书》的可能性, 如回收酶、使用护和其他改变。
Endoreduplication 是细胞放弃典型细胞周期的过程, 取而代之的是经过反复重复 DNA 复制而没有细胞分裂的交替发展过程。由此产生的细胞将增加 DNA 含量和核大小, 这被认为在细胞调控、扩张和专业化中发挥作用。一般而言, 一轮 endoreduplication (称为 endocycle) 和相应增加的 dna 含量与较大的细胞体积相关, 观察, 沉淀的 “karyoplasmic 理论”, 增加 DNA 含量需要适当调整更大的、可能更复杂的单元格1。这种现象在高等植物中很常见, 在一系列组织中被观察到, 包括结构/防御 (毛)2,3, 营养 (玉米胚乳)4,5和水槽/存储 (西红柿果皮;马铃薯块茎)6,7,8函数。在水果中, 有人建议 endoreduplication 在促进果皮的快速扩张方面起到了作用, endoreduplication 与果实发育期的负相关关系也证明了9。例如, DNA 含量高达512C 的细胞 (单倍体基因组的512倍) 已经在西红柿果皮8中观察到。此外, endoreduplication (2014) 表明, 细胞周期基因表达的改变可能导致果皮内的水平增加, 然后导致较大的水果10。因此, 改变基因促进 endoreduplication 提供了一个潜在的目标, 以改善生物量或产量通过植物育种或遗传操作。然而, 这种改进取决于对 endoreduplication 的原因和后果的进一步了解。
Endoreduplication 通常是通过流式细胞仪测量的, 即在粗组织制剂中释放的细胞核11, 用 DNA 结合荧光孵化, 如碘碘化12 (PI)。过滤后的样品然后通过激光的流式细胞仪, 其中的发射波长特定的荧光可以观察到。每个事件 (即,核) 的荧光强度与粒子的 DNA 含量直接相关。因此, 通过比较已知的标准, 可以计算给定样本中细胞的相对和绝对 DNA 含量。Endoreduplication 指数 (EI) 是通过观察细胞 dna 含量 (C 值) 来确定样本中每细胞 endocycles 的平均数量 (1C), 其中, 6.7 是单倍体细胞的 dna 含量 (该协议步骤中提出的公式)。例如, 在一个双倍的有机体中, 体细胞的基本 DNA 含量是2C。如果一个样本的细胞数为 4C, 相当于一轮 endoreduplication, 或更大, 它将有一个近0的 EI;然而, 如果几乎所有的细胞是4C 的 EI 将是大约1。然而, 由于多轮的 endoreduplication 是常见的高等植物观察到的 EI 值可能会更大。虽然计算 endoreduplication 指数可能比较简单, 但它要求可靠地确定核 C 值的相对丰度, 这在某些物种和组织 (包括马铃薯块茎) 中被排除。细胞解剖、化学或细胞壁组成的差异可能是13导致这些样品不符合典型的准备使用剃刀刀片将原子核直接释放到适当的缓冲, 通常使用与组织如西红柿果皮, 模型为 endoreduplication 研究8。
在马铃薯中, 对块茎内的 endoreduplication 的检查仍仅限于一对夫妇的研究, 也许部分原因是由于上述原油制剂产生不一致的结果而缺乏可靠的协议。尽管这种方法对树叶很管用, 但块茎样品经历了严重的退化和大量的碎片形式的噪音, 使得由不同 c-值的原子核组成的峰的分化几乎是不可能的。这可能是由于细胞组成的差异和块茎细胞内大量的细胞碎片 (e. g. 淀粉储存淀粉体)。为了克服这一障碍, 我们最近开发了一种更可靠的方法来获取马铃薯块茎流式细胞术中可分辨峰。每个峰值中的细胞频率可以用来计算不同基因型或不同组织组成块茎的准确 endoreduplication 水平。该协议采用了改进的原生质体提取方法14,15前面描述的流式细胞术11, 在马铃薯的亲属、品种和组织中显示出相当大的变化16.在这里, 我们通过评估在倍体, 组织和块茎大小的范围内的 EI 来详细介绍该协议。
本文提出的协议为研究人员提供了一种评估马铃薯块茎内 endoreduplication 的方法, 其修饰的细胞含量和增加的细胞大小似乎排除了其他流式细胞术的准备。该议定书依赖于原生质体的产生, 以此来减少噪音和碎片, 同时保持核完整。以前, 研究人员已经描述了类似的准备, 特别是顽固流式细胞仪样本, 以及利用块茎原生质体研究各种主题, 如发病机制19,20。然而, 根据我们的知识, 没有人将这种块茎原生质体与流式细胞术结合使用, 以研究 endoreduplication。此外, 我们发现, 原生质体的使用比典型的原油制剂更可靠, 以及用于评估块茎 endoreduplication6,7的其他两项研究中采用的技术。在这里, 我们讨论了协议的缺点, 它的执行和样本准备的潜在缺陷, 以及使用它的典型实验的结果。
尽管块茎流式细胞术协议的实用性和可重复性, 但它确实有一些弱点, 应该讨论。首先, 该协议是时间密集型的, 需要两个通宵孵化。此外, 该议定书需要一些昂贵的试剂, 特别是纤维素酶和离析酶。此外, 准备工作是高度时间敏感的, 在几个小时内降级, 这可能会限制在一天内的吞吐量, 特别是如果需要许多事件。最后, 该议定书虽然可靠, 但对样品制备过程中的误差很敏感, 所有这些都似乎对原子核造成损伤, 并降低了质量结果。例如, 微生物污染可能发生在质壁分离和原生质体生成步骤 (1–3.4) 由于不适当的无菌技术。样本污染, 虽然并不总是排除样品的成功, 但似乎大大降低了获得的直方图的质量, 再次可能是由于对细胞核的破坏。
如前所述, 该协议的主要缺点是成本、时间和对错误的敏感性。研究人员可能希望采取措施来缓解这些问题。就成本而言, 打算将该协议应用于许多样本的研究人员可能会考虑修改酶浓度和/或消化步骤的持续时间, 因为不同的组织和基因型可能因反应而异。这包括筛选和回收以前已演示但在此处未使用21的 ES 的可能性。至于时间, 在我们观察中, 有可能免除第一孵化 (质壁分离步骤), 仍然提取原生质体;然而, 它们的完整性和丰度将受到影响, 这对结果产生不利的后果。为了减少样本的恶化, 研究人员可能会认为一些流式细胞术方法涉及使用护 (例如,甲醛) 来保留样本完整性22。这可能是一个有用的手段, 既防止恶化, 并允许样本存储, 而不是原生质体提取和流式细胞术发生在同一天。防止细胞核损耗的另一种方法可能是将核酸酶抑制剂包括在 ES 和/或 FBC 中;虽然 2-巯基乙醇在发展过程中没有明显的变化, 其他抑制剂还没有在这里测试。
在我们的观察中, 最关键的一步是步骤 4.4, 去除所有质壁分离洗液之前添加流式细胞仪缓冲 (FCB)。如果即使是小体积 (< 10 µL) 仍然存在, 样本更可能被降级, 这可能导致一个贫穷甚至失败的样本。这很可能是由于酶溶液中的杂质(例如核酸, 蛋白酶)23,24 , 在潜伏期和样品运行之间的时间, 即使在低浓度下迅速降解细胞核。另一个重要的考虑因素是 PI 和 RNase 孵化步骤的持续时间。正如《议定书》所指出的, 在添加 FCB 之后, 样品在几个小时内不会保持稳定, 因此研究人员可能决定减少这些步骤的持续时间, 以容纳更多的样本或由低核引起的冗长流式细胞术的运行。浓度.这也要求研究人员考虑在每个样本的事件数和要运行的样本总数之间的权衡, 或者考虑前面提到的护的使用情况。
组织与基因型的差异
为提供该协议的结果代表, 我们设计了两个简单的实验, 以确认以前报告的变化的组织和检查的影响, 倍性和基因型。组织实验的结果表明, 该协议产生可重现的结果, 因为髓组织再次被发现具有最高的 EI。有些令人惊讶的软组织, 以前没有被评估过, 它的 EI 值类似于皮质组织, 明显低于髓。这是意想不到的, 因为软组织细胞通常大于髓或皮质细胞, 至少在成熟。一个可能的解释是, 块茎 (90–130 g) 是太不成熟的薄壁细胞, 其中包括大多数块茎体积成熟, 已完全扩大, 并达到其最大 C 值25。这也可以解释为什么双单倍体 (VT_SUP_19) 和加倍的双单倍体 (VT_SUP_19 4x) 显示出显著大于 cv。当从每个基因型取样大约相等大小的块茎时, 从 VT_SUP_19 或等基因系二、四倍体杂交的块茎的最大大小远小于祖。因此, 可能是因为它们相对于最大可达到的尺寸更大而显示出更大的 EI。或者, 差异可能是遗传补充 VT_SUP_19 从其二、四倍体杂交祖的结果。另一种可能性是, 在从二、四倍体杂交提取双单倍体时发生的基因组减少可能会使有害的等位基因被揭穿, 导致植物范围内的压力, 这也被证明有助于提升的EI 26。然而, 这表明研究人员在选择块茎和组织时必须慎重考虑, 以用于比较 EI 值, 特别是基因型之间。
未来应用
本文所描述的协议为研究人员提供了一个了解马铃薯 endoreduplication 的重要工具。它可能允许研究 endoreduplication 的遗传和环境成分, 在块茎组织中发展的时间过程, 以及对自然变化的评估。最终, endoreduplication 可能成为马铃薯改良的一个有希望的目标, 这项承诺将需要可靠的评估手段。
The authors have nothing to disclose.
这项研究由国家科学基金会奖1237969号资助, “解开马铃薯的杂合性, 等位成分, 和拷贝数变异” 和美国农业部特别赠款 2014-34141-22266 (缅因州大学) 到 RV。
Serological pipette | Fisher | 13-676-10k | (sterile) |
Pipet Aid XP (autopipettor) | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
Conical tubes (50 ml) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | (sterile) |
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Globe Scientific | 111558 | |
Microcentrifuge tubes (2 ml) | Globe Scientific | 111552 | |
Vacuum filtration unit (0.22µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 564-0020 | (sterile) |
Vacuum filtration unit (0.45µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | (sterile) |
Cellulase "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
Macerozyme "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
Hemicellulase | Sigma | H2125 | |
Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
MES buffer | Acros Organics | 172590250 | |
Triton X-100 | MP Biochemicals | 194854 | |
Magnesium Chloride (hexahydrate) | Fisher Scientific | M35-500 | |
Calcium Chloride (dihydrate) | Fisher Scientific | C79-500 | |
D-Mannitol | Acros Organics | 423922500 | |
MOPS | Acros Organics | 17263-0250 | |
Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For flow cytometry preparations |
Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R5000 | For flow cytometry preparations |
Cork borers with punch | American Scientific | 2093-02 | For smapling desired tissue |
Forceps | Thermo Fisher Scientific | 16-31 | For smapling desired tissue |
Scalpel | Thermo Fisher Scientific | 08-920B | For smapling desired tissue |
106um stainless steel mesh or other seive of same pore size | New Jersey Wire Mesh Co. | contact company |