הפרוטוקול המתואר במסמך זה היא שיטה למדידת endoreduplication בתוך פקעות של תפוחי אדמה (סולנום יכולת להתקשר אלי). הוא כולל פעולות החילוץ פלסמוליזה ו פרוטופלאסט כדי להקטין את רעש ופסולת בניתוח cytometric במורד הזרם.
Endoreduplication, השכפול של הגנום הגרעיני של התא ללא ציטוקינזה עוקבות, התשואות תאים עם תוכן ה-DNA מוגברת והיא קשורה עם התמחות, פיתוח, עלייה בגודל הסלולר. בצמחים, endoreduplication נראית להקל על צמיחה והתרחבות של רקמות ואיברים מסוימים. ביניהם הוא פקעת של תפוח אדמה (סולנום יכולת להתקשר אלי), אשר עובר הרחבה ניכרת הסלולר במילוי תפקידה של פחמימות אחסון. לפיכך, endoreduplication עשוי לשחק תפקיד חשוב איך הם מסוגלים להכיל את השפע של פחמן. עם זאת, ההריסות הסלולר הנובע שיטות בידוד גרעיני גס של פקעות, שיטות שבהן ניתן להשתמש ביעילות עם עלים, מונע את ההערכה של מדד endoreduplication פקעת (EI). מאמר זה מציג שיטה להערכת פקעת endoreduplication דרך בידודו של protoplasts בזמן בהפגנות תוצאות נציג המתקבלים שונים אחרים, מידרו פקעת רקמות. המגבלות הגדולות של הפרוטוקול הן עלויות וזמן ריאגנט נדרשת הכנת הדוגמא, כמו גם תוחלת החיים קצרה יחסית של דגימות לאחר פירוק של protoplasts. בעוד הפרוטוקול הוא רגיש וריאציה טכני, הוא מייצג שיפור על השיטות המסורתיות של בידוד הגרעין של תאים מיוחדים גדולים אלה. אפשרויות לשיפורים בפרוטוקול כגון מיחזור אנזים, השימוש של כתות ומייצבים, שינויים אחרים מוצעים.
Endoreduplication היא התהליך שבאמצעותו תא forgoes מחזור התא טיפוסי, במקום זה עובר מסלול חלופי של פיתוח בהיקף של סיבובים חוזרים ונשנים של שכפול ה-DNA ללא חטיבת הסלולר. התא שיתקבל יהיה הגדילו את הדנ א וגודל תוכן הגרעינית אשר הוא חשב לשחק תפקיד הסלולר רגולציה, הרחבה, התמחות. באופן כללי, סיבוב של endoreduplication (הנקרא endocycle) והעלייה המתאימים בתוכן DNA משויכים נפח תא גדול, התבוננות שבגינו את “תורת karyoplasmic”, אשר גדל DNA תוכן נדרשת כראוי לווסת גדול יותר, אולי יותר מורכבת, תא1. תופעה זו שכיחה אצל צמחים גבוהים, שיש נצפתה במגוון של רקמות, כולל אלה בעלי מבנה/הגנתי (trichomes)2,3,4,התזונתי (האנדוספרם תירס)5ו (הכיור/אחסון עגבניות לגלעינים; פקעת תפוח אדמה)6,7,8 פונקציות. בפרי, הוצע ש-endoreduplication את תפקיד בקידום ההתרחבות המהירה של לגלעינים כפי שמעידים הקשר השלילי בין endoreduplication ופירות התפתחותית מחזור9. למשל תאים עם תוכן עד 512C (512 פעמים הפלואידי הגנום) נצפו לגלעינים עגבניות8ה-DNA. יתר על כן שבלייה et al. (2014) הוכיח כי שינויים בביטוי הגנים מחזור התא יכול להוביל מגביר רמות endoreduplication בתוך לגלעינים המביא ואז פירות גדולים10. לכן, שינוי של גנים קידום endoreduplication מספק יעד פוטנציאליים לשיפור של ביומסה או התשואה דרך פיתוח זרעים או מניפולציה גנטית. אולם, השיפור הוא מקצוע הבנה טובה יותר של הגורמים וההשלכות של endoreduplication.
Endoreduplication נמדד לרוב דרך cytometry זרימה לפיה מודגרת גרעינים, שיצא ברקמה גסה ההכנות11, עם fluorophore איגוד ה-DNA, כגון propidium יודיד12 (PI). הדגימות מסוננים מועברים ואז על ידי הלייזר של cytometer זרימה איפה יכול להיות שנצפו פליטה אורכי גל ספציפי fluorophore. האינטנסיביות של זריחה בלכל אירוע (קרי, גרעין) קשורה ישירות עם התוכן-דנ א של החלקיק. לפיכך, על ידי השוואת סטנדרט ידוע, התוכן של יחסיים ומוחלטים ה-DNA של תאים במדגם נתון עשוי לחשב. מדדי Endoreduplication (EI) נקבעים על-ידי קביעת המספר הממוצע של endocycles עבור כל תא בטווח מדגם על ידי התבוננות לתוכן ה-DNA סלולארי (C-ערך) ג 1 איפה התוכן ה-DNA של תא הפלואידי (נוסחת הציגה בשלב 6.7 לפרוטוקול). למשל, באורגניזם דיפלואידי, בסיס DNA תוכן תאים סומטיים הוא 2 ג אם לדוגמה יש כמה תאים עם 4C, המתאימים כדי סבב אחד של endoreduplication, או גדול הייתי של EI ליד 0; עם זאת, אם כמעט כל התאים הם 4C EI יהיה כ 1. עם זאת, כמו מספר סיבובים של endoreduplication נפוצים ערכים EI הנצפה של צמחים גבוהים יותר ייתכן גדול הרבה יותר. בעת חישוב מדדי endoreduplication אולי פשוטה יחסית, שזה דורש כי abundances היחסית של גרעינים C-ערכים להיות אמינה לקביעה, אשר היא מנעה מינים מסוימים, רקמות (כולל פקעות תפו א). סביר להניח כי ההבדלים הסלולר אנטומיה, כימיה או קיר התא הרכב13 לגרום הדוגמיות הללו להיות עקשניים על ההכנות טיפוסי באמצעות סכין גילוח כדי לשחרר את הגרעינים ישירות לתוך המתאים מאגרי משמשים עם רקמות כגון עגבניות לגלעינים, מחקרים למודל endoreduplication8.
תפוחי אדמה, הבחינה של endoreduplication בתוך פקעת נותר מוגבל ללימודים רק כמה, אולי בחלקו בשל חוסר פרוטוקול אמין כמו ההכנות גולמי הנ ל להניב תוצאות לא עקביות. עוד גישות כאלה עובד טוב עלים הדגימות פקעת חווים השפלה חמורה, שפע של רעש בצורה של פסולת, גורם הבידול של פסגות מורכבת גרעינים עם שונות C-ערכים כמעט בלתי אפשרי. אולי זה בגלל ההבדלים ההרכב הסלולר ואת בריבוי של פסולת סלולר בתוך פקעת תאים (למשל. אחסון עמילן amyloplasts). כדי להתגבר על המכשול הזה, לאחרונה פיתחנו פרוטוקול אמין יותר לרכישת פסגות ההרים להבדיל cytometry זרימה של פקעות תפוחי אדמה. התדירות של תאים בתוך כל שיא ואז ניתן לחישוב מדויק endoreduplication רמות שונות אחרים או ברקמות שונות המרכיבות את פקעת. הפרוטוקול, אשר מעסיקה הפותח של-15 14,שיטת החילוץ פרוטופלאסט ששונה שתואר קודם לכן לזרום cytometry11, הראה וריאציה ניכר בתוך תפוחי אדמה קרובי משפחה, הזנים, רקמות16 . כאן אנו מציגים את הפרוטוקול בפירוט על-ידי הערכת EI בהקשרים של פלואידיות, רקמות וגודל פקעת.
פרוטוקול שהוצגו במסמך זה מספק חוקרים עם אמצעי כדי להעריך endoreduplication בתוך פקעות תפוחי אדמה, אשר הסלולר ששונה מוגברת ושביעות רצון תא גודל לכאורה למנוע תכשירים אחרים cytometry זרימה. הפרוטוקול נשענת על הדור פרוטופלאסט כאמצעי להפחתת רעש ופסולת תוך שמירה על שלמות הגרעין. בעבר, חוקרים יש תיאר תכשירים דומים לדוגמאות cytometry זרימה עקשניים במיוחד וכן מנוצל פקעת protoplasts ללמוד מגוון רחב של נושאים כגון פתוגנזה19,20. עם זאת, לידע שלנו, אף יש בשילוב שימוש כזה protoplasts פקעת cytometry זרימה כדי ללמוד endoreduplication. יתר על כן, מצאנו את השימוש protoplasts תהיה אמינה יותר מאשר ההכנות גולמי טיפוסיים, כמו גם את הטכניקה מנוצל השניים רק מחקרים אחרים כדי להעריך את פקעת endoreduplication6,7. כאן נדון את החסרונות של פרוטוקול, מוקשים פוטנציאליים ביצוע ודגימת הכנה, ואת התוצאות של ניסוי טיפוסי אשר מעסיקה אותו.
למרות השירות הדיר של פרוטוקול cytometry זרימה פקעת, יש כמה נקודות התורפה אשר ידונו. כדי להתחיל, הפרוטוקול הוא זמן אינטנסיבי, הדורשים incubations לילה שני. יתר על כן, הפרוטוקול דורש קצת יקר ריאגנטים, במיוחד את cellulase ואת macerozyme. בנוסף, ההכנות הם מאוד דחופה, משפילים בתוך מספר שעות, אשר עשוי להגביל תפוקת בתוך יום אחד, במיוחד אם אירועים רבים הם הרצויה. לבסוף, הפרוטוקול, בעוד אמין, רגיש לשגיאות תוך הכנת הדוגמא כל אשר נראה כדי לגרום נזק הגרעינים ואת תוצאות באיכות נמוכה יותר. לדוגמה, זיהום מיקרוביאלי עלולה להתרחש במהלך פלסמוליזה ו פרוטופלאסט דור השלבים (1 – 3.4) בשל הטכניקה aseptic פסולים. זיהום הדגימה, בזמן לא תמיד מסלק את ההצלחה של מדגם, נראה להפחתה משמעותית לאיכות היסטוגרמות שהושג, סביר שוב בשל נזק הגרעינים.
כאמור לעיל, החסרונות העיקריים של הפרוטוקול הם עלויות, זמן, רגישות שגיאות. חוקרים מומלץ לנקוט בצעדים כדי להמתיק בכל אלה. לגבי העלות, חוקרים מתוך כוונה להחיל את הפרוטוקול על דוגמאות רבות לשקול שינוי של ריכוז אנזים ו/או משך השלב לעיכול כמו ברקמות שונות, אחרים עשויים להשתנות ב תגובתיות. זה כולל את האפשרות של סינון, מיחזור של היצרן אשר בעבר הוכח אבל לא הועסק כאן21. לגבי זמן, בהתבוננות שלנו, זה אפשרי לוותר על הדגירה הראשון (שלב פלסמוליזה) ולחלץ עדיין protoplasts; עם זאת, שלמות ושפע שלהם יסבלו, אשר משפיעה לרעה על תוצאות. כדי להפחית את ההידרדרות של דגימות חוקרים עשויים לשקול כי כמה גישות cytometry זרימה לערב את השימוש כתות ומייצבים (למשל, פורמלדהיד) כדי לשמר את שלמות הדגימה22. זה עשוי להיות אמצעי יעיל הן למנוע הידרדרות ולאפשר מדגם אחסון מאשר פרוטופלאסט שיפסקו וזרימה cytometry המתרחשים באותו יום, כפי שהוצג. אמצעי נוסף של מניעת של התשה של גרעין האטום עשוי להיות לכלול מעכב נוקלאז ES ו/או FBC; בעוד מרקפטואתנול התבצע ללא שינויים מורגש במהלך הפיתוח, מעכבי אחרים שלא נבדקו בזאת.
בהתבוננות שלנו, השלב הקריטי ביותר יחיד הוא שלב 4.4, ההסרה של כל פתרון שטיפת פלסמוליזה לפני התוספת של המאגר cytometry זרימה (FCB). אם אפילו אמצעי אחסון קטן (< 10 µL) נשאר, הדגימות נוטים יותר להיות מושפל אשר יכול להוביל דגימה לקויה או אפילו שנכשלו. . זה ככל הנראה בגלל זיהומים בתוך הפתרון אנזים (למשל nucleases, פרוטאזות)23,24 אשר במהירות לבזות את הגרעינים בתקופת הדגירה תקופות זמן בין מדגם פועל, גם בריכוזים נמוכים. שיקול חשוב נוסף הוא משך השלבים הדגירה PI ל RNase. כאמור בפרוטוקול, הדגימות לא יישאר יציב יותר מכמה שעות לאחר תוספת של FCB כך חוקרים עשויים להחליט להפחית את המשך את השלבים הבאים כדי להתאים יותר דוגמאות או cytometry זרימה ארוך הנובע גרעינים נמוך ריכוזים. זה דורש גם החוקר לשקול את עסקת החליפין בין מספר האירועים עבור דגימה מספר דוגמאות ניתן להפעיל או לשקול את השימוש כתות ומייצבים כאמור.
ההבדלים בין רקמות אחרים
כדי לספק תוצאות נציג של הפרוטוקול תיכננו שני ניסויים פשוטים לאשר וריאציה שדווחה בעבר על ידי רקמה ולבחון את השפעת פלואידיות גנוטיפ. התוצאות של הניסוי רקמות מדגימים הפרוטוקול מניב תוצאות לשחזור, כמו רקמות הפקק שוב נמצא יש את EI הגבוהה ביותר. קצת מפתיע parenchyma רקמות, אשר היה בעבר היו מוערכים, היה ערך EI דומה רקמת קורטיקלית, נמוך משמעותית מאשר הפקק. זה היה בלתי צפויות parenchyma תאים הם בדרך כלל גדולים יותר או הפקק או תאים קורטיקליים, לפחות בעת הפירעון. הסבר אפשרי אחד הוא פקעות (90-130 גרם) היו בוגרות עבור התאים parenchyma, המהווים את רוב נפח פקעת בעת הפירעון, מלא מורחבת, הגיעו שלהם C-ערכי מקסימום25. זה גם מסביר למה את dihaploid (VT_SUP_19), את dihaploid כפולים (VT_SUP_19 4 x) הפגינו EI גדול יותר באופן משמעותי מאשר פקעות סופריור cv.; בעוד פקעות בגודל זהה כ היו לטעום מן גנוטיפ כל, הגודל המרבי של פקעות VT_SUP_19 או את tetraploid isogenic הוא הרבה יותר קטן מזה של המייצר. לפיכך, ייתכן כי הם מוצגים EI גדול פשוט בגלל שהם היו גדולים יותר יחסית לגודל המרבי שלהם בר-השגה. לחלופין, ההבדל יכול להיות תוצאה של הצבע המשלים גנטי ש-vt_sup_19 קיבל קדמון tetraploid שלה. אפשרות נוספת היא אולי ההפחתה גנומית שהתרחש ב הפקת dihaploid של tetraploid חסרי אללים ברישול וכתוצאה מכך מתח הצמח כולו, אשר גם הוכח לתרום EI מוגברות26. בכל זאת, זה מדגים שהחוקרים מדוקדקת חייב להעסיק בעת בחירת פקעות ורקמות שישמש עבור השוואה של ערכי EI, ובעיקר בין אחרים.
יישומים עתידיים
פרוטוקול המתוארות במאמר זה מספק חוקרים עם כלי חשוב עבור הבנה endoreduplication תפוחי אדמה. זה עשוי לאפשר ללימודי של מרכיבי גנטיים וסביבתיים endoreduplication, הזמן-הקורס ההתפתחות לאורך הרקמות פקעת, והערכה של וריאציה טבעי. בסופו של דבר, endoreduplication עלולה להפוך מטרה מבטיח לשיפור תפוחי אדמה, התחייבות אשר ידרשו אמצעי הערכה אמינה.
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה מומן על ידי הלאומית למדע קרן פרס מספר 1237969, “להתיר את Heterozygosity קומפוזיציה Allelic, וריאציה מס העתק של תפוחי אדמה”, משרד החקלאות מיוחד גרנט 2014-34141-22266 (מאוניברסיטת Maine) על הקרוואן
Serological pipette | Fisher | 13-676-10k | (sterile) |
Pipet Aid XP (autopipettor) | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
Conical tubes (50 ml) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | (sterile) |
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Globe Scientific | 111558 | |
Microcentrifuge tubes (2 ml) | Globe Scientific | 111552 | |
Vacuum filtration unit (0.22µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 564-0020 | (sterile) |
Vacuum filtration unit (0.45µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | (sterile) |
Cellulase "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
Macerozyme "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
Hemicellulase | Sigma | H2125 | |
Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
MES buffer | Acros Organics | 172590250 | |
Triton X-100 | MP Biochemicals | 194854 | |
Magnesium Chloride (hexahydrate) | Fisher Scientific | M35-500 | |
Calcium Chloride (dihydrate) | Fisher Scientific | C79-500 | |
D-Mannitol | Acros Organics | 423922500 | |
MOPS | Acros Organics | 17263-0250 | |
Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For flow cytometry preparations |
Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R5000 | For flow cytometry preparations |
Cork borers with punch | American Scientific | 2093-02 | For smapling desired tissue |
Forceps | Thermo Fisher Scientific | 16-31 | For smapling desired tissue |
Scalpel | Thermo Fisher Scientific | 08-920B | For smapling desired tissue |
106um stainless steel mesh or other seive of same pore size | New Jersey Wire Mesh Co. | contact company |