Protokollet beskrivs häri är en metod för att mäta endoreduplikation inom knölar av potatis (Solanumtuberosum). Den innehåller plasmolysis och protoplast utvinning steg för att minska buller och skräp i underordnat flöde flödescytometrisk analys.
Endoreduplikation, replikering av en cell nuclear genomet utan efterföljande cytokines, ger celler med ökad DNA-innehåll och är associerade med inriktning, utveckling och öka cellulär storlek. I växter verkar endoreduplikation underlätta tillväxt och expansion av vissa vävnader och organ. Bland dem är knölen av potatis (Solanumtuberosum), som genomgår betydande cellulära expansion uppfylla sin funktion av kolhydrat lagring. Endoreduplikationen kan således spela en viktig roll i hur knölar ska kunna rymma detta överflöd av kol. Dock den cellulära skräp som följd av rå nukleära isoleringsmetoder knölar, metoder som kan användas effektivt med blad, utgör hinder för uppskattning av tuber endoreduplikation index (EI). Denna artikel presenterar en teknik för att bedöma tuber endoreduplikation genom isolering av protoplasts medan visar representativa resultat erhålls från olika genotyper och uppdelade tuber vävnader. De stora begränsningarna i protokollet är tid och reagens kostnader krävs för provberedning samt relativt kort livslängd på prover efter lys av protoplasts. Protokollet är känsliga för teknisk variation, är det en förbättring jämfört med traditionella metoder av nukleära isolering från dessa stora specialiserade celler. Möjligheter till förbättringar i protokollet såsom återvinning enzym, användning av fixativ och andra ändringar föreslås.
Endoreduplikationen är den process genom vilken en cell avstår typiskt cellcykeln och istället genomgår en alternativ kurs utveckling bestående av upprepade rundor av DNA-replikation utan cellulära division. Den resulterande cellen kommer att ha ökat DNA innehåll och nukleära storlek som tros spela en roll i cellulära förordning, expansion och specialisering. I allmänhet krävs en runda endoreduplikation (kallas en endocycle) och den motsvarande ökningen DNA-innehåll är associerade med större cellvolym, en observation som fälls ut i ”karyoplasmic teori” som ökade DNA-innehåll för att korrekt reglera en större, kanske mer komplex, cell1. Fenomenet är vanligt hos högre växter, efter att ha observerats i olika vävnader, inklusive de med strukturella/defensiv (trichomes)2,3, nutritive (majs frövita)4,5, och handfat och förvaring ( tomat fruktväggen; potatis knölen)6,7,8 funktioner. I frukt, har det föreslagits att endoreduplikation spelar en roll för att underlätta den snabba expansionen av fruktväggen vilket framgår av det negativa förhållandet mellan endoreduplikation och frukt utvecklande period9. Till exempel celler med DNA innehåll upp till 512C (512 gånger det haploida genomet) har observerats i tomat fruktväggen8. Vidare Chevalier et al. (2014) visat att förändringar i uttrycket av cellcykeln gener kan leda till ökningar i endoreduplikation nivåer inom fruktväggen som sedan resulterar i större frukt10. Förändring av gener att främja endoreduplikation ger således ett potentiellt mål för förbättring av biomassa eller avkastning genom växtförädling eller genetisk manipulation. Dock villkoras sådan förbättring av större förståelse av orsakerna och konsekvenserna av endoreduplikation.
Endoreduplikation mäts oftast via flödescytometri whereby kärnor, släppt i rå vävnad preparat11, inkuberas med ett DNA-bindande fluorophore, såsom propidium jodid12 (PI). De filtrerade proverna skickas sedan laser av en flödescytometer där utsläpp våglängder specifika för fluorophore kan observeras. Intensiteten av fluorescens i varje händelse (dvs, nucleus) är direkt korrelerad med DNA-innehåll av partikeln. Således, genom att jämföra en känd standard, relativa och absoluta DNA innehållet i celler i ett givet prov kan beräknas. Endoreduplikation index (EI) bestäms genom fastställande av det genomsnittliga antalet endocycles per cell inom ett prov genom att observera cellulär DNA-innehåll (C-värde) där 1C är DNA innehållet i en haploida cell (formeln i steg 6,7 i protokollet). Exempelvis i en diploid organism är bas DNA innehållet i somatiska celler 2C. Om ett prov har några celler med 4C, motsvarar en enda runda av endoreduplikation eller större skulle ha en EI nära 0; men om nästan alla celler är 4C EI skulle vara ungefär 1. Som flera rundor av endoreduplikationen är vanliga hos högre växter observerade EI värden kan dock mycket större. Vid beräkning av endoreduplikation index kan relativt enkelt, det kräver att relativa förekomsten av atomkärnor C-värden vara tillförlitligt, fastställas som är utesluten i vissa arter och vävnader (inklusive potatisknölar). Det är troligt att skillnader i cellulära anatomi, kemi eller cellväggen sammansättning13 orsaka dessa prover vara motsträviga till typiska förberedelserna med ett rakblad för att släppa kärnorna direkt till lämpliga buffertar som vanligen används en modell för endoreduplikation studier med vävnader såsom tomat fruktväggen,8.
I potatis fortfarande undersökning av endoreduplikation inom knölen begränsade till bara ett par studier, kanske beror delvis på bristande ett pålitligt protokoll som de ovannämnda rå preparat ge motsägande resultat. Medan sådana tillvägagångssätt fungerar bra för bladen upplever tuber proverna allvarliga försämringar och ett överflöd av buller i form av skräp, att göra differentiering av toppar som består av kärnor med olika C-värden nästan omöjligt. Detta är kanske på grund av skillnader i cellulära sammansättningen och ett överflöd av cellulära skräp inom tuber celler (t.ex. stärkelse-lagra amyloplasts). För att övervinna detta hinder, utvecklat vi nyligen ett mer pålitligt protokoll för att förvärva distinguishable toppar i flödescytometri av potatisknölar. Frekvensen av celler inom varje topp kan sedan användas för att beräkna korrekta endoreduplikation nivåer för olika genotyper eller olika vävnader som utgör en rotknöl. Protokollet, som sysselsätter en modifierad protoplast utvinning metod14,15 föregångaren tidigare beskrivits flöde flödescytometri11, visade stor variation inom potatis släktingar, sorter och vävnader16 . Här presenterar vi protokollet i detalj genom att utvärdera EI i sammanhangen i ploiditeten, vävnad och knöl storlek.
Det protokoll som presenteras häri ger forskare möjlighet att bedöma endoreduplikation inom potatisknölar, vars modifierade mobilnät innehåll och ökad cell storlek till synes utesluter andra flöde flödescytometri preparat. Protokollet bygger på protoplast generation som ett sätt att minska buller och skräp samtidigt som nukleära integritet. Tidigare har forskare beskrivit liknande preparat för särskilt motsträviga flöde flödescytometri prover samt utnyttjade tuber protoplasts för att studera olika ämnen såsom patogenes19,20. Dock till vår kunskap, har ingen kombinerat användningen av sådana tuber protoplasts med flödescytometri för att studera endoreduplikation. Vi fann dessutom användningen av protoplasts att vara mer tillförlitliga än typiska råolja preparat samt tekniken utnyttjas i två endast andra studier för att bedöma tuber endoreduplikation6,7. Här diskuterar vi bristerna i det protokollet, potentiella fallgropar i sitt utförande och prov förberedelse, och resultatet av en typisk experiment som sysselsätter det.
Trots de verktyg och repeterbarhet av protokollet tuber flöde flödescytometri har den några svagheter som bör diskuteras. Till att börja med är protokollet dags intensiva, som kräver två natten inkubationer. Protokollet kräver dessutom vissa dyra reagenser, särskilt cellulase och macerozyme. Förberedelserna är dessutom mycket tidskänsliga, förnedrande inom några timmar, vilket kan begränsa genomströmning inom en enda dag, särskilt om många händelser önskas. Slutligen, protokollet, medan tillförlitliga, är känslig för fel inom provberedning som verkar leda till skador på kärnor och lägre kvalitetsresultat. Till exempel kan mikrobiell kontaminering inträffa under plasmolysis och protoplast generation stegen (1-3,4) på grund av felaktig aseptisk teknik. Prov kontaminering, medan inte alltid utgör hinder för framgång för ett prov, verkar dramatiskt minska kvalitet av erhållna histogram, igen sannolikt på grund av skada till kärnor.
Som tidigare nämnts är de stora nackdelarna med protokollet kostnader, tid och känslighet för fel. Forskare vill vidta åtgärder för att mildra dessa. Vad gäller kostnad, forskare som avser att tillämpa protokollet till många prover kan överväga att ändra de enzym koncentrationer eller varaktigheten av steget matsmältningen som olika vävnader och genotyper kan variera i lyhördhet. Detta inbegriper möjligheten att filtrering och återvinning ES som visats tidigare men inte sysselsatt här21. När det gäller tid, i vår observation, är det möjligt att undvara den första inkuberingen (plasmolysis steget) och fortfarande extrahera protoplasts; men deras integritet och överflöd kommer att lida, vilket inverkar negativt resultat. För att minska försämringen av prover kan forskare anser att vissa flöde flödescytometri metoder innebär användning av fixativ (t.ex. formaldehyd) att bevara provet integritet22. Detta kan vara ett användbart sätt att både förebygga försämring och möjliggöra prov förvaring snarare än protoplast exaction och flöde flödescytometri som förekommer på samma dag som presenteras. Ett annat sätt att förebygga bortfall av atomkärnor kan vara att inkludera en nuclease hämmare av ES eller FBC; medan 2-merkaptoetanol sker inga märkbara förändringar under utveckling, har andra-hämmare inte testats i häri.
I vår observation är det mest kritiska steget steg 4.4, avlägsnande av alla plasmolysis tvättlösningen före tillsats av flöde flödescytometri bufferten (FCB). Om även en liten volym (< 10 µL) återstår proven är mycket mer sannolikt att försämras vilket kan leda till en dålig eller ens misslyckade prov. Detta beror sannolikt på orenheter inom enzym lösningen (e.g. nukleaser, proteaser)23,24 som snabbt försämra atomkärnor under inkubation perioder och tiden mellan provet körs, även vid låga koncentrationer. Ett annat viktigt övervägande är varaktigheten av de PI och RNase inkubationsstegen. Som noterades i protokollet, förblir proverna inte stabil i mer än ett par timmar efter tillägg av FCB så forskare besluta att minska varaktigheten av dessa steg för att rymma fler prover eller långa flödescytometri körs som härrör från låga kärnor koncentrationer. Detta kräver också forskaren att överväga avvägningen mellan antalet händelser per prov och totala antalet prover att köras eller överväga att använda fixativ som tidigare nämnts.
Skillnader mellan vävnader och genotyper
För att ge resultat representant i protokollet utformat vi två enkla experiment för att bekräfta tidigare rapporterade variation genom vävnad och undersöka påverkan av ploiditeten och genotyp. Resultaten av vävnad experimentet visar att protokollet ger reproducerbara resultat, märg vävnad konstaterades återigen har den högsta EI. Något överraskande parenkymet vävnad, som inte hade tidigare utvärderats, hade ett EI värde liknar kortikal vävnad och betydligt lägre än märg. Detta var oförutsedda som parenkymet celler är vanligtvis större än antingen märg eller kortikal celler, åtminstone på förfallodagen. En möjlig förklaring är att knölarna (90 – 130 g) var alltför omogna för parenkymet cellerna, som utgör majoriteten av tuber volym på förfallodagen, till fullo har expanderat och nådde sin högsta C-värden25. Detta kan också förklara varför dihaploid (VT_SUP_19) och den dubblerade dihaploid (VT_SUP_19 4 x) visade signifikant större EI än cv. överlägsen rotknölar. medan knölar av ungefär samma storlek var urvalet från varje genotyp, är den maximala storleken på knölar från antingen VT_SUP_19 eller den syngena gräsart mycket mindre än fadern. Det kan således vara att de visas större EI helt enkelt eftersom de var större i förhållande till deras högsta uppnåeliga storlek. Alternativt kan skillnaden vara en följd av den genetiska komplement VT_SUP_19 fick från dess gräsart stamceller. En annan möjlighet är att den genomiska sänkning som inträffade på utvinning av dihaploid från gräsart kan ha unmasked skadliga alleler som resulterar i hela anläggningen stress, vilket också har visat sig bidra till förhöjda EI26. Detta visar dock noggrant övervägande forskarna måste anställa när du väljer knölar och vävnader som ska användas för jämförelse av EI värden, särskilt mellan genotyper.
Framtida tillämpningar
Protokollet beskrivs i denna artikel ger forskare med ett viktigt verktyg för förståelse endoreduplikation i potato. Det kan möjliggöra studier i de genetiska och miljömässiga komponenterna av endoreduplikation, tid-kursen utveckling över knölen vävnader och bedömning av naturlig variation. Endoreduplikationen kan i slutändan göra en lovande måltavla för potatis förbättring, ett företag som kommer att kräva en tillförlitliga metoder för utvärdering.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning har finansierats av National Science Foundation Award nummer 1237969, ”nysta upp den heterozygositet, alleliska sammansättning och kopia nummer variant av potatis” och USDA särskilda bidrag 2014-34141-22266 (University of Maine) till RV.
Serological pipette | Fisher | 13-676-10k | (sterile) |
Pipet Aid XP (autopipettor) | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
Conical tubes (50 ml) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | (sterile) |
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Globe Scientific | 111558 | |
Microcentrifuge tubes (2 ml) | Globe Scientific | 111552 | |
Vacuum filtration unit (0.22µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 564-0020 | (sterile) |
Vacuum filtration unit (0.45µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | (sterile) |
Cellulase "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
Macerozyme "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
Hemicellulase | Sigma | H2125 | |
Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
MES buffer | Acros Organics | 172590250 | |
Triton X-100 | MP Biochemicals | 194854 | |
Magnesium Chloride (hexahydrate) | Fisher Scientific | M35-500 | |
Calcium Chloride (dihydrate) | Fisher Scientific | C79-500 | |
D-Mannitol | Acros Organics | 423922500 | |
MOPS | Acros Organics | 17263-0250 | |
Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For flow cytometry preparations |
Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R5000 | For flow cytometry preparations |
Cork borers with punch | American Scientific | 2093-02 | For smapling desired tissue |
Forceps | Thermo Fisher Scientific | 16-31 | For smapling desired tissue |
Scalpel | Thermo Fisher Scientific | 08-920B | For smapling desired tissue |
106um stainless steel mesh or other seive of same pore size | New Jersey Wire Mesh Co. | contact company |