Nukleinsyre degradering arkivering vev, svulst heterogenitet og mangel på frisk frosne vevsprøver kan negativt påvirke kreft diagnostiske tjenester i rutinelaboratorier over hele verden. Dette manuskriptet beskriver optimalisering av et panel av biomarkers bruker en multiplex magnetiske perle analysen for å klassifisere brystkreft.
Nukleinsyre degradering arkivering vev, svulst heterogenitet og mangel på frisk frosne vevsprøver kan negativt påvirke kreft diagnostiske tjenester i rutinelaboratorier over hele verden. Gene forsterkning og uttrykk diagnostiske tester arkivinnhold materiale eller materiale som krever transport til vedlikehold laboratorier, trenger en mer robust og nøyaktig test tilpasset gjeldende kliniske arbeidsflyter. Vår forskningsteam optimalisert bruk av Invitrogen™ QuantiGene™ Plex analysen (Thermo Fisken Naturvitenskapelig) å kvantifisere RNA i arkivmateriale bruker forgrenet-DNA (bDNA) teknologi for Luminex xMAP® magnetiske perler. Gene expression analysen beskrevet i dette manuskriptet er en roman, rask og multiplex metode som kan nøyaktig klassifisere brystkreft i ulike molekylær subtyper, utelater subjektivitet av tolkning i imaging teknikker. I tillegg lav input materiale kreves, heterogene svulster kan være laser microdissected med Hematoxylin og Eosin (H & E) farget deler. Denne metoden har et bredt spekter av mulige programmer inkludert svulst klassifisering med diagnostiske potensial og måling av biomarkers i flytende biopsier, som ville tillate bedre pasient ledelse og sykdommen overvåking. I tillegg er kvantitativ måling av biomarkers i arkivmateriale nyttig i onkologi research tilgang til biblioteker av klinisk kommenterte materiale, der retrospektiv studier kan validere potensielle biomarkers og sin kliniske utfall korrelasjon.
Optimalisering av RNA basert analyser med formalin-fast parafin-embedded (FFPE) arkivmateriale er utfordrende på grunn av variasjoner i kirurgiske vev behandling og nedbrytning av RNA skyldes formalin brukes for vev integritet bevaring1, 2. For å overvinne begrensning av resultater nøyaktig gene expression studier fra arkivmateriale, brukt vår gruppe bDNA multiplex magnetiske perle analysen. I stedet for enzymatisk forsterkning av en mål-mal bruker bDNA teknologien hybridisering av bestemte sonder og forsterkning av en reporter signal3. Kort anerkjennelse sekvenser av fangst og gjenkjenning sonder er utformet til å hybridize kort fragmenter av målet RNA4. I tillegg overvinner bruk av vev homogenates som direkte utgangsmaterialet i denne analysen, uunngåelige tap av RNA som analyser krever forutgående RNA utvinning og rensing. Signalforsterkning, bruk av kort anerkjennelse sekvenser og utelukkelse av en rensing trinnet bidrar til reduksjon i teknisk variant av analysen. Teknologien gir muligheten til å multiplex analysen (opptil 80 RNA mål) og måle uttrykk for et panel av mål fra lav materiale inngang. Denne protokollen beskriver utarbeidelsen og flekker av for laser microdissection. Flekker på membran lysbildene lette avbilding av svulsten og histologiske arkitektur å gi nøyaktige utvalg og profilering av: (1) svulst og normal kanaler i brystvev, og (2) ondartet cellen kloner i heterogene svulster.
Molekylær klassifisering av brystkreft er en prosess som interrogates molekylære markører for å kategorisere pasienten svulster i tre molekylær klasser, dvs., luminal, menneskelige epidermal vekstfaktor reseptor 2 (HER2)-beriket, og basal undertype. HER2-beriket undertypen er godt definert, med høy uttrykk for HER2 reseptoren, på grunn av ERBB2 genet forsterkning, kombinert med lav eller fraværende østrogenreseptor (ER) og progesteron reseptor (PgR). Luminal undertypen er generelt positive for ER og basale undertypen er i de generelle negativ for tre reseptorer (HER2, ER, PgR) og betydelig overlapper med trippel negative bryst kreft (TNBC) diagnostiske undertype5,6. Andre markører brukes til å fastsette epitel og mesenchymal egenskaper. Fibronectin (FN1) er en viktig komponent i bryst vev mesenchymal batterirommet. Økt FN1 uttrykk er ledsaget av høy Ki67 flekker, og viser en signatur for mer invasiv svulst7,8 og er forbundet med metastasering9. Interessant, ble FN1 funnet for å være til stede i microvesicles fra kreftceller, som forårsaket aktiveringen av mitogenic signaler i mottakerens fibroblaster10. Derfor sirkulerer microvesicles som exosomes er en potensiell markør for tidlig oppdagelse eller metastasering og tilbakefall11.
Svulst området utvalg for bryst kreft transcriptional subtyping blitt recurrently utført av macrodissection12,13. For å overvinne vev heterogenitet og øke følsomhet, har vi pålitelig kombinert klassisk vev flekker multiplex molekylær profilering metoder. Som et bevis på prinsippet, er to distinkte bryst kreft kloner definert ved sin epithelial mesenchymal signatur og metastatisk potensial. Arbeidsflyten beskrevet protokollen kan lett oversatt til gjeldende kliniske oppsett og brukes å selektivt isolere og karakterisere vev subtyper med målrettet mRNA profilering.
En perle-baserte multiplex bDNA analysen var optimalisert for å kvantifisere genuttrykk på degradert RNA FFPE bryst kreft vev og normal bryst kanaler. Optimalisere analysen, normalisere involvert utvikle en algoritme for å klassifisere brystkreft svulster i luminal og basal subtyper 8 kjente biomarkers og 5 potensielle gener. Data normalisering ble gjort ved hjelp av permutasjoner av normalisering gener. Valg av normalisering genene var basert på beste prediksjon av reseptor status ved hjelp av Luminal/Basal klassifiserer gener. For å klassifisere Luminal/Basal subtyper fra FFPE vev, var normalisering genene valgt Beta-utgangen (ACTB), Glyceraldehyde 3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) og Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).
Metoden kan tilpasses for bruk i andre diagnose og forskningsområder etter tilstrekkelig utvalg av normalisering genet settet. En viktig anvendelse av denne metoden i forskning sektor er måling av biomarkers i arkivmateriale som er godt kommentert med kliniske utfall. Dette kunne validere potensielle prediktiv markører i retrospektiv studier, raskt og nøyaktig, og unngå langsiktige prospektive studier venter sykdom-fri overlevelse og total overlevelse data. Vår gruppe er for tiden undersøker bruk av analysen å oppdage reseptor-positiv exosomes, som krever utvikling av en ny algoritme med alternative normalisere gener for data normalisering. Bruk av flytende biopsier og robust gene expression analyser vil tillate høy gjennomstrømning multiplex analyser tilpasset pasient ledelse under behandling, og gir et middel til å følge behandling effekt, potensielle tilbakefall på grunn av motstand mot terapi, og metastatisk kapasitet av svulsten.
Denne metoden har også et bredt spekter av mulige anvendelser i diagnostisering av svulster og er tilpasset den gjeldende diagnostiske arbeidsflyten. De viktigste fordelene med denne metoden i feltet diagnostiske inkluderer: (1) gjennomføring av høy gjennomstrømning analyser, (2) unntatt subjektivitet og tvetydig resultater fra bilde-baserte målinger, (3) nøyaktig påvisning av flere mål samtidig, som forbedrer nøyaktigheten og minimere bruken av dyrebare pasientprøvene, og (4) ingen krav til høyt spesialiserte fasiliteter og menneskelige ressurser. Optimalisert prøvetaking prosessen, sammen med lav input materiale kreves for perle-baserte multiplex analysen, innrømmer undersøkelse av svulst heterogenitet; ved hjelp av laser microdissection nøyaktig skille flere foci av ondartet vev fra samme pasient delen, er det mulig å sammenligne flere genuttrykk mellom dem og sammenfallende normalt vev (Figur 4). Lav er materiale avgjørende for minnediagnostiseringsprogrammet på svulst biopsier som gir begrenset tumor vev. Kapasiteten til analysen å måle genuttrykk fra degradert RNA prøver kan lett transport av prøver for analyse i institusjon eller vedlikehold laboratorier. I tillegg var hele delen analyse også mulig å bruke H & E farget materiale (figur 1).
Suksessen til denne protokollen, er det viktig å: (1) sikre riktig utvalg av svulst området/s som er lysed for analysen og (2) utvikle godt optimalisert og godkjent data normalisering algoritmer, for hver genet uttrykk panel og/eller personlige Prognostisk eller prediktiv biomarkers. Tidligere avhenger av teknisk erfaring av tekniker/vitenskapsmann utfører prøvetaking. Det anbefales å ta en ekstra core og forberede en vev microarray (TMA) i samme format til multiplex magnetiske perle analysen (96-brønns format). Dette vil gi et arkiv av svulst som kopi av prøver brukes for RNA-baserte analysen. TMAs kan også vurderes med andre teknikker for oppfølging forskning eller validering av resultatene. Utvikling av normalisering algoritmer er avhengig av materialet etterforsket og normalisering genene valgt for normalisering. Ulike paneler med å normalisere gener velges basert på nivå og variasjon av uttrykket i eksemplet analysert og dette varierer mellom kreft vev fra forskjellige steder, exosomes plasma eller sirkulerende kreftceller. Validering av analysen omfatter prøve behandling siden forskjellige preparater vil også resultere i forskjellige normalisering algoritmer.
For å oppsummere, bruk av bDNA teknologi i kombinasjon med magnetiske perle teknologi og valg av riktig panel av målet gener, vil gi den ekstra fordelen av måle genuttrykk direkte i vev lysates avledet fra små mengder pasienten materiale, inkludert microdissected materiale, exosomes og sirkulerende kreftceller. I tillegg til oppdagelsen av svulst heterogenitet har riktig bruk av paneler potensial til å oppdage svulst avledet exosomes for tidlig diagnostikk og tidlig deteksjon av anfall. Siden det er ikke behov for et nukleinsyre forsterkning trinn, signalforsterkning bruker bDNA teknologi, kombinert med perle-baserte multipleks, måler flere byggkorn under klinisk kommenterte arkivmateriale og gi en ressurs for biomarkør validering.
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet ble støttet av (1) et bryst kreft prosjekt stipend (2014-2016) finansiert av handlingen for Breast Cancer Foundation og ALIVE 2013 gjennom forskning, innovasjon og utvikling stoler (RIDT) av University of Malta, (2) fakultet & Kirurgi, University of Malta og (3) prosjektet ACT finansiert av Malta Rådet for vitenskap og teknologi gjennom FUSION: The R & I teknologi utvikling programmet 2016. Utgivelsen av dette manuskriptet støttes gjennom Jove-Luminex stipendet.
Microtome | Leica | RM2235 | |
Heamatoxylin Mayer's | Sigma | MHS16-500mL | |
Eosin Y Aquaeous solution | Sigma | HT110216-500mL | |
Normal Rabbit Serum | Monosan | MONX10963 | Working dilution: 1/40 |
Biotinylated Rabbit anti-mouse | Dako | E0354 | Working dilution: 1/200 |
ER antibody (6F11) | Vector Laboratories | VPE614 | Working dilution: 1/45 |
HER2 antibody (CB11) | Novocastra | CB11-L-CE | Working dilution: 1/325 |
Ki67 antibody (MIB-1) | Dako | M7240 | Working dilution: 1/500 |
Avidin Biotin Complex kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
Nikon Eclipse Ti-E Inverted microscope | Nikon | Ti-E | 4x, 10x, 20x and 40x objectives |
Laser Microdissection membranes | Molecular Machines &Industries | S0103 | |
mmi CellCamera 1.4 | Molecular Machines &Industries | MX4285c-ACK07 | |
mmi Cellcut Plus | Molecular Machines &Industries | ||
Diffuser caps | Molecular Machines &Industries | 50210 | |
mmi Celltools Software v.4.01rcl | Molecular Machines &Industries | ||
Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355000038 | |
1.5mL heating block for Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22670522 | |
96-well plate heating block for Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 22670565 | |
Labnet Vortemp 56 Shaking incubator | Labnet | 52056A-220 | |
LX200 100/200 | Luminex | Magnetic bead analyser | |
Invitrogen QuantiGene Sample Processing Kit – FFPE Tissues | ThermoFisher Scientific | QS0109 | |
Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Assay Kit (Magnetic Separation) | ThermoFisher Scientific | QP1011 | |
Thermaseal RTS Sealing Film | Thermaseal | 765246 | |
Hand-Held Magnetic Plate Washer | ThermoFisher Scientific | QP1011 | |
Invitrogen QuantiGene Incubator Temperature Validation Kit | Affymetrix/Panomics | QS0517 | |
Proteinase K (50µg/µL) | ThermoFisher Scientific | 14622 | |
Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Sets | ThermoFisher Scientific | Various | |
Multi Speed Vortex | Kisker Biotech | MSV-3500 | |
Sonicator | Silvercrest | ||
RNASEZAP | Sigma | R2020-250ML | |
Aluminium 96-well plate seal | Sigma | Z721549-100EA | |
Temperature Validation Kit | ThermoFisher Scientific | QS0517 | |
RapidMiner Studio Community 7.1.001 | RapidMiner | Data Science Platform | |
Hybridisation oven | Hybaid (Thermo Scientific) |