En Optogenetic metode for å styre og analysere Gene Expression mønstre i celle til celle interaksjoner
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å analysere celle til celle overføring av oscillasjon informasjon av optogenetic kontroll og live overvåking av genuttrykk. Denne tilnærmingen gir en unik plattform for å teste en funksjonell betydning av dynamisk gene expression programmer i flercellet systemer.
Abstract
Cellene skal svare riktig på timelig skiftende omgivelser, som er påvirket av ulike faktorer fra de omliggende solcellene. Hakket signalveien er en slik viktig molekylær maskiner for celle til celle communications, som spiller nøkkelroller i normal utvikling av embryo. Denne veien omfatter en celle til celle overføring av oscillasjon informasjon med ultradian rytmer, men til tross for fremgangen i molekylærbiologi teknikker, har det vært utfordrende for å belyse virkningen av flercellet samhandlinger på oscillasjon genet dynamikk. Her presenterer vi en protokoll som tillater optogenetic kontroll og live overvåking av genet uttrykk mønstre på en presis timelige måte. Denne metoden avslørt har at intracellulær og intercellulære periodiske innganger hakk signalnettverk entrain iboende svingninger av frekvens tuning og fase skiftende i én celle oppløsning. Denne fremgangsmåten gjelder analyse av dynamiske funksjoner i ulike signalveier, gir en unik plattform for å teste en funksjonell betydning av dynamisk gene expression programmer i flercellet systemer.
Introduction
Celle til celle kommunikasjon spille viktige roller i embryonale mønstre i utviklingsprosesser. I virveldyr embryoer dannes metameric strukturer kalt somites langs anterior-posterior kroppen aksen med en presis timelige nøyaktighet under kontroll av en holder klokke, kalt segmentering klokken1. Under denne prosessen, en gruppe presomitic mesoderm (PSM) celler regelmessig konverteres til somites i en synkron måte. Denne prosessen innebærer synkronisert oscillasjon genuttrykk og PSM cellene som svinge i fase danner de samme somites. Den oscillasjon genuttrykk er rundt 2-3 h i mus og ca 30 min i sebrafisk. Når skilt, PSM cellene mister synkronisering2,3, men når de er re aggregerte, de kan selv organisere og gjenopprette befolkningen synkronisering4, antyder at celle-celle kobling er en nøkkel for den synkroniserte svingninger.
Omfattende arbeid avslørte at signalnettverk molekyler i Delta-hakk veien er tett koblet til synkroniserte svingninger av segmentering klokke genene. Farmakologiske hemmere eller genetiske mutasjoner hakk signalnettverk desynchronize befolkningen i oscillatorer. I sebrafisk vise mutanter av hakk signalering komponenter, for eksempel DeltaC, DeltaD og Notch1a, asynkron svingninger5,6. I kylling eller musen embryoer er ikke bare hakk ligand Delta-like1 (Dll1), men også hakk Modulator galning fringe (Lfng) nødvendig for synkroniserte svingninger7,8,9. Men det har vært vanskelig å teste forbedrer Funksjonsmulighetene av slike molekyler for dynamisk informasjon overføring fra celle til celle, fordi timelige vedtak av konvensjonelle forstyrrelsene av genet regulering dynamikken ikke var tilstrekkelig til å undersøke den prosesser av tidsskalaer 2-3 h (ultradian rytmer).
Vi har nylig utviklet en integrert metode for å kontrollere og overvåke genet uttrykk mønstre i pattedyrceller10. Denne teknologien lar induksjon av gene expression pulser av periodiske lys belysning på ultradian tidsskalaer. Denne protokollen representerer metodene fotosensitive cellelinjer og observere dynamisk svar reporter celler av live-celle luminescence overvåking i sammenhenger av celle-til-celle kommunikasjon. Denne metoden gjelder analyse av mange andre signalveier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi viste en metode for å kontrollere gene expression dynamics med en periodisitet av 2-3 h. Denne tidsskala er mye kortere enn de i andre konvensjonelle systemer, inkludert Tet på systemet og opprinnelige LightOn system. Nøkkelparameterne å nå de ultradian tidsskalaer er halv-livene til Foto-indusert molekylær produkter, mRNAs og proteiner. Parameterne kinetic kan avhenge celletyper og arter. Tuning av kinetikk, er erstatte Hes1 3 UTR sekvenser med andre en rett frem måte, fordi det ikke endrer funksjonene sekvens…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av JST, PRESTO (A.I.), Core forskning for Evolutional vitenskap og teknologi (JPMJCR12W2 (RK)), Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning på nyskapende områder (Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap og teknologi (MEXT), Japan 26119708 (A.I.) og 16 H 06480 (RK)), vitenskapelig forskning (A) (Japan Society for fremme av vitenskap (JSPER) 24240049 (RK)), og unge forskere (A) (Javaserver 15t 05326 (A.I.)), og en Grant-in-Aid for vitenskapelig forskning på nyskapende områder “fluorescens Live bildebehandling”MEXT, Japan og plattform for dynamiske tilnærminger til levende System fra MEXT, Japan.
Materials
| FACS | Becton, Dickinson and Company | FACSAriaII SORP | |
| Camera | Andor | iKon M-934 | |
| Microscope | Olympus | IX-81 ZDC | |
| PMT device | Churitsu eletric corp. | CL24B-LIC/B | |
| Blue LED illuminator | OptoCode | LEDB-SBOXH | |
| DMEM | Nacalai | 08459-35 | |
| Penicillin-streptomycin | Nacalai | 26253-84 | |
| Fetal bovine serum | Sigma | 172012 | |
| KRYSTAL24 (black 24 well plate ) | Hi-tech | 303012 | |
| D-Luciferin Potassium Salt | Nacalai | 20028-24 | |
| Light meter | LI-COR Biosciences | LI-250A | |
| anti-HA-Peroxidase antibody | Roche | clone 3F10 | |
| anti-Actin-Peroxidase antibody | Wako | clone 2F3 |
References
- Hubaud, A., Pourquie, O. Signalling dynamics in vertebrate segmentation. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).
- Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourquié, O. Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact. Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).
- Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).
- Tsiairis, C., Aulehla, A. Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns. Cell. 164, 656-667 (2016).
- Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock. Nature. 408, 475-479 (2000).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics. Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).
- Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourquié, O. Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock. Nature. 421, 275-278 (2003).
- Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling. Nat. Commun. 3, 1141 (2012).
- Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis. Genes Dev. 30, 102-116 (2016).
- Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information. Genes Dev. 31, 524-535 (2017).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).
- Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342, 1203-1208 (2013).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, S7 (2007).
- Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy. BMC Biotechnology. 10, 3 (2010).
- Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -. M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).
- Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. The onset of collective behavior in social amoebae. Science. 328, 1021-1025 (2010).
- Kellogg, R. A., Tay, S. Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs. Cell. 160, 381-392 (2015).
