Tradisjonelle metoder for å vurdere adipogenic differensiering er billig og enkel å bruke, men er ikke spesifikke for endringer i genuttrykk. Vi har utviklet en analysen for å kvantifisere mesenchymal celledifferensiering i eldre adipocytter med en slektslinje spesifikk markør. Denne analysen har forskjellige programmer over grunnleggende forskning og klinisk medisin.
Flere fargestoffer er tilgjengelige for bruk i å oppdage differensiering av mesenchymal celler i adipocytter. Fargestoffer, som olje Red O, er billig, lett å bruke og vidt utnyttet av laboratorier analysere adipogenic potensialet av mesenchymal celler. Men er de ikke spesifikke for endringer i genet transkripsjon. Vi har utviklet en gen-spesifikke differensiering analysen analysere når en mesenchymal celle har byttet sitt skjebnen til en adipogenic avstamning. Immuno-merking mot fettsyrer bindende protein-4 (FABP4), en slektslinje kundespesifikk markør for adipogenic differensiering, aktivert visualisering og kvantifisering av differensierte celler. Evne å kvantifisere adipogenic differensiering potensialet i mesenchymal celler i 96 godt microplate format har lovende implikasjoner for en rekke applikasjoner. Hundrevis av kliniske studier innebærer bruk av voksen mesenchymal stromal celler og det er foreløpig vanskelig å korrelere terapeutiske resultater innenfor og spesielt mellom slike kliniske studier. Denne enkle høy gjennomstrømming FABP4 analysen gir en kvantitativ analyse for å vurdere differensiering potensialet i pasient-avledet celler og er et kraftig verktøy for å sammenligne ulike isolasjon og utvidelse metoder. Dette er spesielt viktig gitt den økende erkjennelsen av heterogenitet cellene blir administrert til pasienter i mesenchymal celler. Analysen har også potensielle verktøyet i høy gjennomstrømning narkotikarelaterte screening, spesielt i fedme og pre-diabetes.
En av de viktigste kravene av det internasjonale samfunnet for mobilnettet terapi (ISCT) til å definere en multipotent mesenchymal stromal celle er at cellene må ha evnen til å differensiere i adipogenic, osteogenic og chondrogenic linjene 1. konvensjonelle metoder for måling differensiering inn disse tre linjene er avhengige av gjenkjenning av macromolecular produkter med kjemiske fargestoffer1. Fargestoffer som olje Red O (som flekker fett dråper i celler som har gjennomgått adipogenesis), er billig og lett å bruk; men de ikke klarer å oppdage de bestemte endringene i genuttrykk som oppstår når mesenchymal cellene skille i hver respektive lineage2. Her har vi utviklet en differensiering analysen som quantifies protein uttrykk for en adipogenic avstamning-spesifikk markør, fettsyrer bindende protein-4 (FABP4)3,4,5. FABP4 ble først funnet i murine 3T3-L1 adipocytter3 og ble senere oppdaget å bli uttrykt i menneskelig subkutan fettvev6. Det er en cytosolic proteiner, som fungerer som en Anstandsdame lede fettsyrer opptak ved celler og er involvert i prosessen med lipolyse4.
De forløper cellene brukes for differensiering analyser var adipose avledede mesenchymal stromal celler (ASCs)7,8. ASCs deler mange egenskaper med Ben margtransplantasjon-avledet stamceller (BM-MSCs), en stor mesenchymal stamceller befolkning i voksne8,9. ASCs tilbyr flere fordeler sammenlignet med BM-MSCs i en klinisk anvendelse, som større avkastning celler som kan isoleres fra lettere tilgjengelig vev kilder8,9. En isolert celle befolkningen må oppfyller visse kriterier skal defineres som ASCs. Først må de vise tilslutning til plast vev kultur fartøy i standard kultur forhold1. De må også vise spesifikke overflate antigen uttrykk1. Uncultured ASCs er preget av positiv overflate antigen uttrykk for CD34, CD73, CD90, lav uttrykk for CD105 og negativ uttrykk CD45 og HLA-DR10. ASCs renset ved dyrking på plast i 28 dager (tilhenger renset ASCs) viser positive uttrykk for CD73, CD90 og CD105 og negativ uttrykk for CD34 og CD45 HLA-DR10. Til slutt, cellene må beholde evnen til å differensiere i ulike linjene1,7,8.
Adipogenic differensiering protokoller indusere slående oppregulering av FABP4 uttrykk blant andre adipocyte avstamning gener, så vi brukt immunochemistry for å visualisere FABP4 protein i celler, og deretter kvantifisert FABP4 uttrykk på enkeltcelle nivå bruker en automatisert fluorescerende høyt innhold screening mikroskop. Denne metoden er fordelaktig over tradisjonell fargestoffer som gjør at svært spesifikke bekreftelse på adipocyte-lineage differensiering. Slike genet bestemt avstamning analyser kombinert med høyt innhold screening metoder også aktivere kvantifisering av andelen av celler innenfor en heterogen celle forberedelse som kan differensiering ned en bestemt avstamning. I våre studier brukte vi FABP4 analysen for å bekrefte tap av adipogenic differensiering potensialet i fersk isolert ASCs etter cellekultur.
Dette dokumentet demonstrerer av og fordelene med FABP4 immunolabelling å nøyaktig oppdage og kvantifisere moden adipocytter avledet fra mesenchymal stromal celler. FABP4 er kjøpedyktig merker endringer i uttrykk for en slektslinje bestemt protein3,4,5 i eldre adipocytter, i motsetning til andre ofte brukte fargestoffer som etiketten macromolecular endres13,14 som olje Red O15, Nilen Red16 og Sudan svart17. FABP4 immunolabelling gir visualisering og analyse av endringer i mobilnettet morfologi. Dette er en særegen fordel over beskrevet tidligere metoder ved hjelp av kvantitative omvendt transkripsjon PCR (RT-qPCR) som analyserer endringer på transkripsjon nivå uten noen visualisering5,18,19 ,20eller flowcytometri som krever celler i suspensjon20eller Western blotting som krever cellene være lysed for å isolere protein19,20. FABP4 immunolabelling er stabilt i fast celler, lekke ikke ut i løsningen og blir en cytosolic proteiner når merket i en tilhenger monolayer av celler, overlapper med kjernen tillater enkel visualisering og lagt til nøyaktighet i automatisk analyse.
Høyt innhold screening er en fordel fordi det er rask, nøyaktig, reproduserbare og objektiv. Det gir en plattform for kostnadseffektiv bruk reagenser og forsker, siden bildeopptak og analyse krever minimal manuell manipulasjon og stole på den automatiske behandlingen av instrumentet. Flere faktorer ble identifisert som kritisk nøyaktigheten og reproduserbarhet av høyt innhold screening søk31. Kvantifisering av antigen uttrykk er avhengig av bildekvalitet. For vellykket bildeanalyser, bilder fra hver kanal per brønn må være i fokus og innenfor en optimal dynamikkområdet grå verdier (automatisk vise innstillinger er ideell). Ut av fokus eller mettede bilder føre til feilaktige resultater.
Noen potensielle begrensninger av metodene i denne artikkelen omfatter følgende: Behovet for spesialisert tenkelig utstyr og analyse. Mens du er utenfor omfanget av denne artikkelen, kan alternativ åpen kildekode programvarealternativer (for eksempel ImageJ32,33, Fiji34, CellProfiler32,35) brukes til å utføre lignende bildesegmentering oppgaver. men de krever kompetanse til å enten laste ned og skreddersy makroer tilgjengelig online eller skrive makroer/kommandoer for deres spesifikke analyse rørledninger. Iboende til alle automatisert tenkelig analyse rørledninger er et nivå av bakgrunnsstøy. Dette kan i stor grad tilskrives rusk, dårlig bilde kvalitet eller analyse feil, understreker behovet for forsiktig utvalg forberedelse og forsiktig oppsett av bildebehandling og analyse plattform. FABP4 etiketten i mus har blitt funnet for å oppdage udifferensierte progenitors30; mens kontrollene i denne studien (som består av udifferensierte celler) er blottet for bestemte FABP4 flekker. Dette under score nødvendigheten av å sjekke FABP4 uttrykk i udifferensierte progenitors i hver biologisk sammenheng der analysen er ansatt.
For å trekke gyldig sammenligninger mellom FABP4 merking og olje Red O flekker, belastningsstyring fra bildeanalyser måtte være biologisk relevant. Følgelig måling, ‘% positiv celler’ ble brukt for FABP4 og ‘området av flekker per celle’ ble brukt olje Red O. Det er bemerkelsesverdig at tiltaket ‘% positiv celler’ ikke ble brukt olje Red o merket celler i vår studie fordi det ikke var mulig å tillegge de merket fett dråpene nøyaktig til en gitt kjerne; de fett dråpene variert betydelig i størrelse, antall og distribusjon over celle kroppen og sjelden overlappet kjernen. Olje Red O flekker variasjon eksisterer mellom celler fra ulike vev kilder; mens % positiv celler mål ikke var riktig for denne studien, en annen gruppe har brukt det med hell for å kvantifisere adipocytter avledet fra menneskelige kjertel stamceller22 der den olje Red O flekker dukket opp som en stor feit slippverktøy som spredte den cytoplasma og overlappende med kjerner og aktivere data presenteres som % positiv celler.
Morfologi av FABP4 immunolabelling er derimot konsekvent i adipocytter fra en rekke ulike vev kilder23,24,25. Evne å kvantifisere andelen av celler innenfor en kultur kan differensiering har en rekke programmer. Voksen mesenchymal stromal celler holde store løftet for en rekke ulike terapeutisk bruk. Et betydelig problem som har oppstått med klinisk oversettelse er iboende variasjon i evnen til disse cellene mellom pasienter26mellom områder av isolasjon27,28og mellom metoder for isolasjon12 og utvidelse av celle tall12 for terapeutisk bruk. Det har vist tidligere at kulturer tilhenger stromal celler er ofte heterogene, med noen celler kan differensiering og noen ikke 12,17 som vår FABP4 analysen demonstrerer for ASC kulturer. Søk som dette, kombinert med berikelse teknikker, vil bidra til å identifisere Sub-populasjoner i ulike kulturer kan slektslinje kundespesifikk differensiering. Å ha en standardisert, målbare analysen som denne FABP4 analysen gir en enkel metode for sammenligning mellom alle disse variablene, og potensial til å evaluere terapeutiske resultater innenfor og mellom kliniske studier.
Kvantifisering av FABP4 på en semi-automatisert måte kan objektivitet og reproduserbarhet analyse over mange donor tilfeller og eksempler. Videre som etiketten er cytoplasmatiske, kan det potensielt bli brukt til å analysere hypertrophy (utvidelse av adipocyte størrelse) i tillegg til hyperplasia (økning i adipocyte tall), et skille som er av stor betydning i fedme forskning, der hypertrofi er sterkt assosiert med adipose dysfunksjon i overvektige personer21. Fedme-epidemien har ansporet betydelig interesse identifisere narkotika kan styre lipid lagring. Denne FABP4 analysen gir også en enkel avlesning for screening tusenvis av forbindelser for sin evne til å hemme lipid akkumulering.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige for givere liggende under adipose vev og forskning fagfolk som samler inn og gir denne ressursen oss til forskningsbruk. Vi ønsker å erkjenne finansiering støtter Allergan. Vi er også takknemlige til Universitetet i Auckland, Fakultet for medisinsk og Health Sciences ytelse basert Research Fund for finansiering filmet og redigering for innlevering av denne artikkelen.
Tris Base | Invitrogen | 15504-020 | Tris buffered saline |
Sodium Chloride | Merck | 1064041000 | Tris buffered saline |
Potassium Chloride | Merck | 1049360500 | Tris buffered saline |
Sodium Azide | Scharlau | SO0091 | Casein blocker solution |
Casein | Sigma | C7078-500G | Casein blocker solution |
PBS tablet | Sigma | P4417-100TAB | Phosphate buffered saline |
DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | Cell culture |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | Cell culture |
Fetal bovine serum | Gibco | 10091-148 | Cell culture |
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12563-029 | Cell dissociation enzyme |
96 well plate (flat bottom) | Falcon | FAL353072 | Cell culture equipment |
T75 culture flask, with filter cap | Greiner | 658175 | Cell culture equipment |
Insulin | Sigma | 19278-5ML | Adipogenic differentiation media |
dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | Adipogenic differentiation media |
indomethacin | sigma | I7378-5G | Adipogenic differentiation media |
Oil-Red O | Sigma | O-0625 | Classic stain for adipogenesis |
Isopropanol | Merck | 1.09634 | Classic stain for adipogenesis |
16% formaldehyde | Pierce | 28908 | Cell fixation |
Acetone | Merck | 100983 | Cell fixation |
DAPI | Sigma | D9542 | Immunocytochemistry |
Anti rabbit IgG alexa 488 | Molecular Probes | A11008 | Immunocytochemistry |
Thimerosal | Sigma | T5125-10G | Immunocytochemistry |
Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody | Cayman Chemicals | 10004944 | Marker of adipogenesis |
Centrifuge tubes (15mL) | Greiner | GR188271 | General |
Centrifuge tubes (50mL) | Greiner | GR227261-P | General |
ImageXpress Micro XLS | Molecular Devices | high content screening machine | |
MetaXpress | Molecular Devices | high content screening software, version 5.4.01 |