Traditionella metoder för att bedöma adipogena differentiering är billiga och lätt att använda, men är inte specifika för förändringar i genuttryck. Vi har utvecklat ett test för att kvantifiera mesenkymala celldifferentiering i mogen adipocyter använder en härstamning specifik markör. Denna analys har applikationsmöjligheter över grundforskning och klinisk medicin.
Flera färgämnen är tillgängliga för användning i att upptäcka differentiering av mesenkymala celler in adipocyter. Färgämnen, såsom olja röd O, är billigt, lätt att använda och allmänt utnyttjad av laboratorier analysera adipogena potential av mesenkymala celler. Men är de inte specifika för förändrad transkription av gener. Vi har utvecklat en gen-specifika differentiering analysen att analysera när en mesenkymala cell gått sitt öde till en adipogena härstamning. Immuno-märkning mot fettsyra bindande protein-4 (FABP4), en härstamning-specifik markör för adipogena differentiering, möjliggjort visualisering och kvantifiering av differentierade celler. Möjligheten att kvantifiera adipogena differentiering potential mesenkymala celler i en 96 väl mikroplattan format har lovande konsekvenser för ett antal applikationer. Hundratals kliniska prövningar innebär användning av vuxna mesenkymala stromaceller och det är för närvarande svårt att korrelera terapeutiska resultat inom och särskilt mellan sådana kliniska prövningar. Denna enkla hög genomströmning FABP4 analys ger ett kvantitativt test för bedömning av differentiering potential patientderiverade celler och är en robust verktyg för att jämföra olika metoder för isolering och expansion. Detta är särskilt viktigt med tanke på det ökande erkännandet av heterogenitet cellerna som administreras till patienter av mesenkymala celler produkter. Analysen har också potentiella verktyg i hög genomströmning drogkontroll, särskilt i fetma och pre-diabetes forskning.
En av de viktigaste kraven som fastställts av den internationella föreningen för cellulära terapi (ISCT) definiera en multipotenta mesenkymala stromaceller cell är att cellerna måste ha förmågan att skilja in i adipogena, Osteogena och chondrogenic härstamningar 1. konventionella metoder för att mäta differentiering in dessa tre utvecklingslinjerna lita på detektion av makromolekylära produkter använder kemiska färgämnen1. Färgämnen som olja röd O (som fläckar feta liten droppe i celler som har genomgått adipogenesis), är billig och lätt att använda; men de misslyckas med att identifiera de specifika förändringarna i genuttryck som uppstår när mesenkymala celler differentieras till varje respektive lineage2. Här har vi utvecklat en differentiering-analysen som kvantifierar proteinuttryck för en adipogena härstamning-specifik markör, fettsyra bindande protein-4 (FABP4)3,4,5. FABP4 hittades ursprungligen i murina 3T3-L1 adipocyter3 och upptäcktes senare skall uttryckas i mänskliga subkutan fettvävnad6. Det är ett cytosoliskt protein, som fungerar som ett förkläde att vägleda fettupptaget av celler och är involverat i processen lipolys4.
Av prekursorceller som används för differentiering analyserna var fett härledda mesenkymala stromaceller (ASCs)7,8. ASCs delar många egenskaper med benmärg-derived mesenkymala stamceller (BM-msc), en större mesenkymala stamceller befolkning i vuxna8,9. ASCs erbjuder flera fördelar jämfört med BM-MSCs i en klinisk tillämpning, som större avkastning av celler kan isoleras från mer lättillgängliga vävnad källor8,9. En isolerad cell befolkning måste uppfylla vissa kriterier för att definieras som ASCs. De måste först Visa adherencen till plast vävnadsodling fartyg i standard kultur villkor1. De måste också visa specifika ytantigen uttryck1. Obildade ASCs karakteriseras av positiva ytantigen uttryck av CD34, CD73, CD90, lågt uttryck av CD105 och negativa uttryck för CD45 och HLA-DR10. ASCs renas genom odling på plast i 28 dagar (anhängare renat ASCs) visar positivt uttryck av CD73, CD90 och CD105 och negativa uttryck av CD34, CD45 och HLA-DR10. Slutligen måste celler kvar möjligheten att differentieras till olika härstamningar1,7,8.
Adipogena differentiering protokoll inducera slående uppreglering av FABP4 uttryck bland andra fettceller härstamning gener, så vi använde immunkemi för att visualisera FABP4 protein i cellerna, och sedan kvantifieras FABP4 uttryck på enstaka cellnivå använda en automatiserad fluorescerande hög-innehåll screening mikroskopet. Denna metod är en fördel över traditionella färgämnen som gör det möjligt för mycket specifik bekräftelse av fettceller-lineage differentiering. Sådana gen specifika härstamning analyser kombineras med hög halt screeningmetoder också möjliggöra kvantifiering av andelen celler inom en heterogen cell beredning som klarar av differentiering ner en viss härstamning. I våra studier använde vi FABP4 analysen för att bekräfta förlusten av adipogena differentiering potential av nymalen isolerade ASCs efter cellodling.
Detta papper visar nyttan och fördelarna med FABP4 immunolabelling att exakt identifiera och kvantifiera mogen adipocyter härrör från mesenkymala stromaceller. FABP4 är kunna upptäcka förändringar i uttrycket av en härstamning specifikt protein3,4,5 i mogen adipocyter, tvärtemot andra vanligen används färgämnen som makromolekylära ändras13,14 såsom olja röd O15, Nile röd16 och Sudan svart17. FABP4 immunolabelling möjliggör visualisering och analys av förändringar i cellulära morfologi. Detta är en distinkt fördel jämfört med tidigare beskrivna metoder använder kvantitativa omvänd Transkription PCR (RT-qPCR) som analyserar förändringar på nivån avskrift utan någon visualisering5,18,19 ,20, eller flödescytometri som kräver celler i suspension20eller Western blotting som kräver celler att vara lyserat för att isolera protein19,20. FABP4 immunolabelling är stabil i fasta celler, läcker inte i lösning och att vara ett cytosoliskt protein när märkas i en vidhäftande enskiktslager av celler, överlappar med kärnan möjliggör enkel visualisering och noggrannhet i den automatiserad analysen.
Hög-innehåll screening är fördelaktigt eftersom den är snabb, korrekt, reproducerbar och sakligt. Det ger en plattform för kostnadseffektiv användning av reagenser och forskare tid, eftersom bild förvärv och analys kräver minimal manuell manipulation och förlita sig på automatisk behandling av instrumentet. Flera faktorer identifierades som kritiska till noggrannheten och reproducerbarheten av hög-innehåll screening analyser31. Kvantifiering av antigen uttryck är beroende av bildkvalitet. För framgångsrika bildanalys, bilder från varje kanal per brunn måste vara i fokus och faller inom en optimal dynamiska omfånget för gråvärden (Auto exponera inställningar är perfekt). Out-of-fokus eller mättade bilder leda till felaktiga resultat.
Vissa potentiella begränsningar av de metoder som beskrivs i denna artikel omfattar följande: Kravet för specialiserade bildgivande utrustning och analysprogram. Utanför tillämpningsområdet för denna artikel, kan alternativa öppen källkod programvarualternativ (till exempel ImageJ32,33, Fiji34, CellProfiler32,35) användas för att utföra liknande bild segmentering uppgifter. men de kräver kompetens att antingen hämta och skräddarsy makron tillgängliga online eller skriva makron/kommandon för deras särskild analys rörledningar. Inneboende till alla automatiserade imaging analys rörledningar är en nivå av bakgrundsbrus. Detta kan till stor del tillskrivas skräp, dålig bild kvalitet eller analys fel, betonar behovet av noggrann provberedning och noggrann inställning av bildbehandling och analys-plattformen. FABP4 etiketten i möss har visat för att upptäcka odifferentierade föräldraparets30; medan de kontroller i denna studie (som består av odifferentierade celler) saknar specifika FABP4 färgning. Detta under Poäng nödvändigheten av att kontrollera FABP4 uttryck odifferentierade stamfäder i varje biologiska sammanhang där analysen är anställd.
För att dra giltiga jämförelser mellan FABP4 märkning och olja röd O färgning, utgång mätningarna från bildanalys behövde vara biologiskt relevanta. Följaktligen, mätning, ‘% positiva celler’ användes för FABP4, och ‘area av färgning per cell’ användes för Oil Red O. Det är anmärkningsvärt att måttet ‘% positiva celler’ inte användes för olja röd O märkt celler i vår studie eftersom det inte var möjligt att exakt tillskriva märkta fett droppar en viss kärna; de feta liten dropparna varierade betydligt i storlek, antal och fördelning mellan cellkroppen och sällan överlappas med kärnan. Olja röd O färgning variation finns mellan celler som härrör från olika vävnad källor; medan % positiva celler åtgärd inte var lämpligt för den aktuella studien, en annan grupp har använt det framgångsrikt för att kvantifiera adipocyter härrör från mänskliga körtel stamceller22 där olja röd O färgningen uppträdde som ett stort fett droplet som sträckte sig över de cytoplasman och överlappade med kärnor och aktivera data som ska presenteras som procent positiva celler.
Morfologi av FABP4 immunolabelling är däremot konsekvent adipocyter härrör från en rad olika vävnad källor23,24,25. Möjligheten att kvantifiera andelen celler inom en kultur som är kapabel av differentiering har ett antal applikationer. Adult mesenkymala stromaceller håll betydande löfte för en rad olika terapeutiska användningar. Ett betydande problem som har uppstått med kliniska översättning är det inneboende variabilitet i kapaciteten hos dessa celler mellan patienter26, mellan platser av isolering27,28och mellan metoder för isolering12 och expansion av cell nummer12 för terapeutiskt bruk. Det har tidigare visat att kulturer av vidhäftande stromaceller är ofta heterogen, med vissa celler kan differentiering och några inte 12,17 som våra FABP4 visar analysen för ASC kulturer. Analyser som detta, kombinerat med anrikning tekniker, kommer att hjälpa till att identifiera subpopulationer inom heterogen kulturer kan härstamning-specifika differentiering. Att ha en standardiserad, kvantifierbara analys såsom denna FABP4 analys ger en enkel metod för jämförelse mellan alla dessa variabler, och potential att utvärdera terapeutiska resultat inom och mellan kliniska prövningar.
Kvantifiering av FABP4 på ett halvautomatiskt sätt möjliggör objektivitet och reproducerbarhet i analysen över många givare fall och prover. Vidare som etiketten är cytoplasmiska, det kan potentiellt vara används för att analysera hypertrofi (förstoring av fettceller storlek) förutom hyperplasi (ökning fettceller nummer), en distinktion som är av avsevärd betydelse för fetma forskning, där hypertrofi är starkt förknippad med fett dysfunktion hos överviktiga individer21. Fetmaepidemin har sporrat en betydande mängd intresse att identifiera droger kan styra lipid lagring. Denna FABP4 analys ger också en enkel avläsning för screening tusentals föreningar för sin förmåga att hämma lipid ackumulering.
The authors have nothing to disclose.
Vi är tacksamma att donatorerna till erhållsgenom och forskning proffs som samlar in och förse oss med denna resurs för forskningsändamål. Vi skulle vilja erkänna finansieringsstöd av Allergan. Vi är också tacksamma till University of Auckland, Faculty of Medical och Health Sciences prestanda baserat forskningsfond för att finansiera kostnaderna för videoing och redigering för inlämning av denna artikel.
Tris Base | Invitrogen | 15504-020 | Tris buffered saline |
Sodium Chloride | Merck | 1064041000 | Tris buffered saline |
Potassium Chloride | Merck | 1049360500 | Tris buffered saline |
Sodium Azide | Scharlau | SO0091 | Casein blocker solution |
Casein | Sigma | C7078-500G | Casein blocker solution |
PBS tablet | Sigma | P4417-100TAB | Phosphate buffered saline |
DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | Cell culture |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
Glutamax | Gibco | 35050-061 | Cell culture |
Fetal bovine serum | Gibco | 10091-148 | Cell culture |
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red | Gibco | 12563-029 | Cell dissociation enzyme |
96 well plate (flat bottom) | Falcon | FAL353072 | Cell culture equipment |
T75 culture flask, with filter cap | Greiner | 658175 | Cell culture equipment |
Insulin | Sigma | 19278-5ML | Adipogenic differentiation media |
dexamethasone | Sigma | D2915-100MG | Adipogenic differentiation media |
indomethacin | sigma | I7378-5G | Adipogenic differentiation media |
Oil-Red O | Sigma | O-0625 | Classic stain for adipogenesis |
Isopropanol | Merck | 1.09634 | Classic stain for adipogenesis |
16% formaldehyde | Pierce | 28908 | Cell fixation |
Acetone | Merck | 100983 | Cell fixation |
DAPI | Sigma | D9542 | Immunocytochemistry |
Anti rabbit IgG alexa 488 | Molecular Probes | A11008 | Immunocytochemistry |
Thimerosal | Sigma | T5125-10G | Immunocytochemistry |
Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody | Cayman Chemicals | 10004944 | Marker of adipogenesis |
Centrifuge tubes (15mL) | Greiner | GR188271 | General |
Centrifuge tubes (50mL) | Greiner | GR227261-P | General |
ImageXpress Micro XLS | Molecular Devices | high content screening machine | |
MetaXpress | Molecular Devices | high content screening software, version 5.4.01 |