Her beskriver vi en protokoll for å finne lunge fungal byrden i mus med invasiv aspergillose av kvantifisering av Gomoris modifisert methanamine sølv flekker i histologiske deler. Bruk av denne metoden resulterte i sammenlignbare resultater med mindre dyr sammenlignet med vurdering av sopp byrden av kvantitative PCR lunge fungal DNA.
Kvantifisering av lunge fungal byrde er avgjørende for fastsettelse av relativ nivåene av immun beskyttelse og fungal virulens i musen modeller av lunge soppinfeksjon. Selv om flere metoder brukes til å vurdere fungal byrden, kvantitativ polymerasekjedereaksjons (qPCR) av sopp DNA har dukket opp som en teknikk med flere fordeler sammenlignet med tidligere kultur-baserte metoder. Foreløpig nødvendiggjør en helhetlig vurdering av lunge patologi, leukocytter rekruttering, fungal byrden og genuttrykk i mus med invasiv aspergillose (IA) bruk av et betydelig antall eksperimentelle og kontroll dyr. Her ble kvantifisering av lunge histologiske flekker for å fastslå fungal byrden med et redusert antall dyr undersøkt i detalj. Lunge deler var farget for å identifisere fungal strukturer med Gomoris modifisert methanamine sølv (GMS) flekker. Bildene ble tatt fra GMS-farget delene fra 4 separate felt av hver formalin-fast parafin-embedded lunge. GMS farget områder innenfor hvert bilde kvantifisert bruker et bilde analyse, og fra denne kvantifisering, mener andelen stained området ble fastslått for hvert utvalg. Bruker denne strategien, redusert eosinophil dårlig mus utstilt fungal byrden og sykdom med caspofungin terapi, mens vill-type mus med IA ikke ble bedre med caspofungin. Tilsvarende fungal byrden i mus mangler γδ T celler ble også forbedret ved caspofungin, målt ved qPCR og GMS kvantifisering. GMS kvantifisering er derfor innført som en metode for bestemmelse av relativ lunge fungal byrden som til slutt redusere antall forsøksdyr kreves for omfattende studier av invasiv aspergillose.
IA er en opportunistisk infeksjon som kan utvikle hos disponerte individer med medfødt eller ervervet immun mankoen på grunn av immun undertrykkende terapi eller kronisk infeksjon1,2. Primær infeksjon ofte oppstår i lungene, men i noen tilfeller formidling av Aspergillus fumigatus lever, nyrer, hjertet og hjernen kan oppstå, som resulterer i omfattende vev invasjonen av hyfer ledsaget av alvorlig sykdom og høy utbredelsen av dødelighet1,2. Videre effekten av eksisterende farmakoterapi er begrenset, og kan bli ytterligere svekket av fremveksten av soppdrepende-resistente stammer i miljøet3. Derfor er det viktig å forstå mekanismene for sopp virulens og vert patologi som fremmer utvikling eller forverring av invasiv fungal sykdommen.
Murine modeller fortsatt viktig for mekanistisk IA studier, som de tillater forskere å vurdere rollene fungal virulens gener og vert immun effektor for etablering og vekst av A. fumigatus i vivo4,5. Følgelig utarbeidet flere strategier for å effektivt kvantifisere eller sammenligne fungal byrden i grupper forsøksdyr6,7. Disse strategiene omfatter kultur-basert, biokjemiske, immunanalyse eller qPCR metoder, hver med forskjellige fordeler og ulemper. Videre hver av disse metodene omfatter innvielsen av et delsett av dyr i tillegg til de ofret for vurderinger av immun effektor funksjon, gene expression analyse og komparativ histopatologi7. Dermed krever omfattende IA studier ofte betydelig antall forskning dyr til en betydelig kostnad. Effektive strategier som reduserer eksperimentelle tid, dyr kostnader og etiske betraktninger ved å benytte dyr vev for flere analyser er derfor svært verdifull7.
I denne rapporten er en metode som beskriver kvantifisering av GMS farging i histologiske seksjoner for sammenligning av relativ fungal byrden eksperimentelle undergrupper av mus med IA innført. Hvert trinn fra sopp kultur infeksjon, vev innhøsting og behandling, og bildeopptak dataanalyse, er beskrevet i detalj. Fungal byrdene ved GMS kvantifisering ble sammenlignet med qPCR neutropenic modeller av IA og caspofungin-behandlet vill-type eller eosinophil dårlig mus med IA8. Resultatene viser likhet med GMS kvantifisering og qPCR av sopp DNA. Dette tyder på at GMS kvantifisering kan være nyttig for forskerne engasjert i histologiske analyser som supplerende eller alternativ sammenligning av relativ fungal byrden i mus med IA, og til slutt redusere kostnadene og bruk av forskning dyr i komplekse, mekanistisk studier.
Hensikten med denne artikkelen var å innføre en metode for bestemmelse av lunge fungal byrden i mus med IA ved å benytte GMS-farget lunge histologiske seksjoner for bildeanalyse og kvantifisering. I denne studien, behandling med β Glukan-syntese-målretting soppdrepende stoffet caspofungin14 ble ikke bedre overlevelse eller sopp byrden i neutropenic vill-type mus med IA8. Men i fravær av eosinofile eller γδ T celler, overlevelse og fungal byrden forbedret. Resultatene av vår undersøkelse viste også at sammenlignbare resultater kan oppnås ved GMS fungal byrden i forhold til den brukte fungal DNA qPCR metode6.
Det er flere fordeler med å utnytte GMS fungal byrden kvantifisering. Først kan prosessen utnytte eksisterende histologiske prøver, dermed potensielt redusere antall eksperimenter må bestemme betydelige forskjeller. Andre i denne studien var mindre dyr nødvendige for GMS fungal byrden kvantifisering å oppnå betydelige forskjeller i forhold til qPCR av sopp DNA (figur 6, figur 7). Tredje påvirkes sammenligning av sopp byrden på ulike isolater av qPCR av isolere-avhengige forskjeller i ribosomal DNA kopi nummer15. Derimot er GMS kvantifisering ikke berørt av antall kopier, som sopp byrden bestemmes av relativ lunge soppvekst. Dermed bruk av GMS kvantifisering for sopp belastningen minsker vertebrate dyr og krever ikke før fastsettelse av rDNA kopi. Til slutt, i tillegg til å endre fungal morfologi, caspofungin terapi øker fungal fragmentering og dermed øke kunstig fungal byrden med isolering av kolonien danner enheter fra lunge homogenates12,16 ,17. Dermed unngår GMS kvantifisering av sopp byrden flere begrensninger med andre vanlige metoder.
Begrensningene for GMS kvantifisering og/eller denne studien er imidlertid viktig å merke seg. Først forfatterne antatt en sammenlignbare fordeling av hyphal vekst gjennom lungene av hver forsøksgruppen, og dermed brukes kvantifisering fra 4 representant 10 x objektive felt som et representativt mål for sopp byrden i hele lungene (Figur 6B). Det er mulig at i noen tilfeller relativ fordeling, størrelsen og tettheten av hyphal foci ville tilstrekkelig varierer slik at sopp byrden vises annerledes med denne metoden og tilsvarende av metoden qPCR. Imidlertid våre flere resultater med hele lunge delen kvantifisering ved hjelp av 4 X objektiv viste lignende, men mindre statistisk signifikante forskjeller mellom grupper (figur 6C). Standardfeilen for denne kvantifisering ble økt med denne strategien, sannsynligvis på grunn av redusert hyphal oppløsning med 4 X mål og økt bakgrunn i suboptimal felt. Derfor foretrekkes en representant kvantifisering av færre felt på høyere forstørrelse. Andre er ble bare en enkel, sentral del brukt til hvert utvalg. Det er mulig, basert på sopp isolert eller mus stammer brukes, at noen studier kan resultere i en ujevn fordeling av hyphal vekst. I slike tilfeller, bør inndelinger i hver parafin blokk kvantifiseres for å få et mer representativt byrden. Tredje i eksperimenter som induserer betydelig produksjon av mucins (dvs., kvantifisere airway soppvekst allergisk bronkopulmonal aspergillose (ABPA finner)18 eller cystisk fibrose (CF)18), GMS kryssreaksjon med polysakkarid-rike mucins19 kan ikke-spesifikk GMS + resultater og dermed forskyve eksempler for høyere fungal byrden. Siden bare neutropenic modell av IA ble brukt i denne studien, er det mulig at bruk av andre immun kompetent eller undertrykkende modeller kan resulterer i mindre sammenlignbare resultater. Til tross for disse begrensningene, GMS kvantifisering gir en tilsvarende teknikk for å fastslå fungal byrden, og dens fortsatte bruk i flere studier kan videre validere nytten av denne metoden som konsekvent, pålitelig og kostnadseffektiv.
The authors have nothing to disclose.
Denne studien var støttes delvis av en Indiana universitet skolen av medisin ekstrautstyr forskningsstipend og NIH-NIAID 1R03AI122127-01. N.A. ble delvis støttet i denne perioden av en karriere innen immunologi fellesskap fra den amerikanske foreningen Immunologists.
Aspergillus fumigatus 293 Stock Solution | Fungal Genetics Stock Center | FGSC #A1100 | |
HyPure Cell Culture Grade Water | Thermo Fisher Scientific | SH30529.03 | |
Malt Extract | MP Biomedicals | 2155315 | White Powder |
BD BBL Acidicase Dehydrated Culture Media: Peptone | Fisher Scientific | L11843 | |
Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher Scientific | D16-3 | |
Fisher BioReagents Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
Auto Dry Cabinet | Shanghai Hasuc Instrument Manufacture Co.,LTD | HSFC160FD | |
1300 Series Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 1375 | |
0.5 mm Glass Beads | BioSpec Products | 11079105 | |
15 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
Hemacytometer | Fisher Scientific | # 0267110 | |
Leica Model DME Microscope | Leica | 13595XXX | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500 ml | |
1.5 ml tubes | Fisher Scientific | # 05-408-129 | |
BD Precisionglide syringe needles, gauge 27, L 1/2 in. | Sigma-Aldrich | Z192384 | |
Anti-mouse-Ly-6G antibody | BioXCell | BP0075-1 | Clone 1A8 |
Caspofungin diacetate | Sigma-Aldrich | SML0425 | |
Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 1169567762 | |
Non-Rebreathing Table Top Veterinary Anesthesia Machine | Supera Anesthesia Innovations | M3000 | |
Pureline Oxygen Concentrator | Supera Anesthesia Innovations | OC8000 | |
Slant Board Restraint | Indiana State University Facilities Management | Custom made | |
Gilson PIPETMAN Classic 200 ml Pipets | Fisher Scientific | F123601G | |
Pentobarbital Sodium (Fatal-Plus) | Vortech Pharmaceuticals | 0298-9373-68 | |
General-Purpose Broad-Tipped Forceps | Fisher Scientific | 10-300 | |
Fisherbrand Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
Fisherbrand General-Purpose Curved Forceps | Fisher Scientific | 10-275 | |
Ethyl Alcohol-200 Proof | PHARMCO-AAPER | 111000200 | |
Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-63 | |
BD Precisionglide syringe needles, gauge 25, L 1 in. | Fisher Scientific | Z192406 | |
All-Plastic Norm-Ject Syringes | Fisher Scientific | 14-817-30 | |
IV CATH ANGIOCATH 22GX1GIN 50B | Fisher Scientific | NC9742754 | |
Formalin Solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | |
50 ml Conical Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
Thermo Scientific Shandon Embedding Cassettes II in Tube Packs | Fisher Scientific | B1000729 | |
Fisherfinest Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22-900-700 | |
Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-554 | |
Reichert Jung Histocut 820 Microtome | Labequip.com | 31930 | |
Water Bath | Precision Scientific | 66630-23 | |
CO2 Incubator | Fisher Scientific | 116875H | |
Silver Stain (Modified GMS) Kit | Sigma-Aldrich | HT100A-1KT | |
Fast Green FCF | Fisher Scientific | AC410530250 | |
Frosted Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | |
Fisherfinest Superslip Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-89 | |
Cytoseal XYL | Fisher Scientific | 22-050-262 | |
Olympus Provis AX70 Microscope | Olympus | OLYMPUS-AX70 | |
U-PHOTO Universal Photo System | Olympus | OLYMPUS-U-PHOTO | |
U-MCB-2 MULTI CONTROL BOX | Olympus | OLYMPUS-U-MCB-2 | |
U-PS POWER SUPPLY UNIT | Olympus | OLYMPUS-U-PS | |
FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze Dry System | LABCONCO | 7740020 | |
Maxima C Plus Vacuum Pump | Fisher Scientific | 01-257-80 | Displacement- 6.1 cfm |
1-Butanol | Fisher Scientific | A383-4 | |
AMRESCO PHENOL-CHLORFORM-OSOAMYL 100ML DFS | Fisher Scientific | NC9573988 | |
Free-Standing Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | # 02-682-557 | |
Mini-Beadbeater-24 | BioSpec Products | 112011 | |
BioSpec ProductsSupplier Diversity Partner 2.3 MM ZIRCONIA BEADS | Fisher Scientific | NC0451999 | |
Tris Base (White Crystals or Crystalline Powder/Molecular Biology) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
Hydrochloric Acid, Certified ACS Plus | Fisher Scientific | A144S | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate | Fisher Scientific | S311 | |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), White Powder, Electrophoresis | Fisher Scientific | BP166 | |
Chloroform/isoamyl alcohol 24:1 | Fisher Scientific | AC327155000 | |
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer | Fisher Scientific | 11-120-570 | |
Thermo Scientific™ ABsolute Blue qPCR Mixes | Fisher Scientific | AB4137A | |
Hybridization Probe, 5′-FAM-AGCCAGCGGCCCGCAAATG-TAMRA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
Sense Amplification Primer, 5′-GGCCCTTAAATAGCCCGGT-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
Antisense Amplification Primer, 5′-TGAGCCGATAGTCCCCCTAA-3′ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
Applied Biosystems™ MicroAmp™ Optical 8-Tube Strip, 0.2mL | Fisher Scientific | 43-165-67 | |
Thermo Scientific Domed and Flat PCR Cap Strips | Fisher Scientific | AB-0386 | |
Mx3005P QPCR System, 110 Volt | Agilent | 401443 | Stratagene is now owned by Agilent |
BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 000651 | |
C57BL/6 (B6) mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
Eosinophil-deficient (ΔdblGATA, BALB/c background) mice | The Jackson Laboratory | 005653 | |
γδ T cell-deficient (TCRδ-/-, B6 background) mice | The Jackson Laboratory | 002120 | |
ImageJ Software | National Institutes of Health | N/A | https://imagej.nih.gov/ij/ |
Spot Advanced Software | Spot Imaging | SPOT53A | http://www.spotimaging.com/software/spot-advanced/ |
GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | N/A | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
Fisherbrand Absorbent Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
Step 4.5 | http://www.bdbiosciences.com/sg/resources/protocols/paraffin_sections.jsp ; http://www.jove.com/science-education/5039 ; http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/ht100.pdf |