Eine Methode zur Inselversetzung, Omentum in Maus
Summary
Eine Methode für die omentalis Transplantation von Inseln in einer Maus wird eingeführt. Isolierte Inseln sind mit Hydrogel vermischt und das Gemisch wird in den omentalis Beutel einer diabetischen Maus gebracht. Dann, der Blutzucker wird überwacht, und Immuno-histochemische Analyse erfolgt.
Abstract
Inselversetzung ist vorgeschlagen worden, eine mögliche Behandlung für Typ-1-Diabetes sein. Den letzten überzeugende Hinweise darauf, dass intravaskulären Inselchen Infusion bei weitem nicht Ideal ist und daher das Omentum ist wieder auf dem Vormarsch als potenziell wertvollen Standort für Inselversetzung. Dieses Experiment erfordert die Isolierung von hochwertigen Inselchen und die Implantation von den kleinen Inseln an der diabetischen Empfänger. Transplantation, das Omentum erfordert chirurgische Schritte, die optisch besser nachgewiesen werden können. Hier sind die einzelnen Schritte für dieses Verfahren vorgestellt. Zwei Methoden die isolierte Inseln mit Hydrogel zu mischen, bevor Sie die Mischung in den omentalis Beutel von diabetischen Mäusen platzieren werden hier beschrieben. Verschiedenen Hydrogele werden für die unterschiedlichen Bedingungen verwendet. Blutzuckerspiegel der Diabetiker Maus Empfänger Phänomen Inselchen in der Omentum wurden bis zu 35 Tagen beobachtet. Einige Tiere geopfert wurden nach 14 Tagen, Immuno-histochemische Analyse durchzuführen. Diese prä-klinischen Transplantation Ansatz kann als vorläufige Daten vor der Übersetzung bis zur klinischen Transplantation verwendet werden.
Introduction
Laut der International Diabetes Federation (IDF) betrifft Diabetes Mellitus derzeit 382 Millionen Menschen mit einer projizierten Anstieg auf 592 Millionen Menschen durch 2035-1. In beiden allogene und xenogene Inselversetzung ist systemischer immunsuppressive Therapie notwendig. Ohne Immunsuppression ist Immunabwehr eine der Hauptursachen des Transplantats Verlust2. Auch gibt es ein erhebliches Problem der transplantierten Inselchen Verlust aufgrund der sofortigen Blut vermittelte entzündliche Reaktion (IBMIR)3,4. Aber auch in Abwesenheit einer Immunantwort z. B. in Phänomen oder Auto-Transplantation Modelle, Inselzellen transplantiert in der Leber über die Pfortader verloren aufgrund einer Entzündung und/oder ungünstigen Umgebungsbedingungen, wie z. B. schlechte Durchblutung Versorgung mit eingeschränkter Oxygenierung und/oder Nährstoffe5,6. Infolgedessen um langfristige metabolische Funktion zu gewährleisten, sind höhere Inselchen Zahlen notwendig, um die erste Zelle Verlust auszugleichen, die Engraftment7reduziert.
In einem Versuch, die Insel Engraftment optimieren mehrere alternative anatomische Standorte wurden experimentell untersucht sowie klinisch, mit dem Versprechen, noch keine endgültige Ergebnisse8. Während einige der alternativen Websites einfachen und sicheren Zugang bieten (zB., Haut, Niere Kapsel, gastrische Submukosa und Vorderkammer des Auges) oder eine breitere Fläche für größere Insel Massen (zB., Bauchhöhle), überleben und physiologische metabolische Leistung der transplantierten Inselchen noch begrenzt sind und bleiben ein Anliegen-9. Die Suche nach einem geeigneteren Standort für Inselchen Engraftment ist im Gange.
Das Omentum war unter den vielen anatomischen Stätten, die in der frühen Entwicklung der Inselversetzung untersucht und erwies sich eine erfolgreiche Umgebung für Inselchen10,11,12,13wurden, 14. Allerdings intraportal Inselchen Infusion wurde die klinische Wahl Due teilweise auf die relative Einfachheit des Verfahrens und erste Erfolge in der Tier-Modelle6. Auch auszugsweise, die negative damit verbundenen Website, besonders massive frühem Verlust der Insel, waren weniger verstanden und weniger einschränkend in den frühen Tagen der experimentellen Inselversetzung als Feld gereift. Mit neueren zwingende Beweise, die darauf hinweist, dass intravaskulären Inselchen Infusion weit von ist eignet sich das Omentum wieder auf dem Vormarsch als potentiell wertvolle Website für Stammzelltransplantation.
Das Omentum (in Form von einem omentalis Beutel) bietet relative Vorteile gegenüber der Leber15,16. Es ist gut vaskularisierte und leicht zugänglich. Es ermöglicht Abruf des Transplantats (falls erforderlich) und/oder Biopsie. Die ischämische Periode erlebt durch die kleinen Inseln ist im Vergleich zu der Leber reduziert, und das Omentum kann relativ akzeptieren, dass große Inselchen Massen, die nicht intraportally, wo ein Druckanstieg Portal kann Komplikationen verursachen können.
Ein Phänomen Mausmodell der Transplantation diente in das Protokoll in der Studie beschäftigt C57BL/6 männliche Mäuse zwischen 6 – 8 Wochen alt, mit einem Körpergewicht von 20 – 25, g. Islet Empfänger Diabetiker mit einer einzigen Injektion von Streptozocin mit einer Dosis von 250 gerendert wurden, getestet mg/kg Ip. Die Induktion von Diabetes kann als erfolgreich, wenn der Blutzuckerspiegel der Maus größer als 24 Mmol/L 48 h nach der Injektion ist und über diesem Niveau bei einem Mindestaufenthalt von 5 Tagen bleibt.
Phänomen Inselchen wurden isoliert aus der Bauchspeicheldrüse von Alter abgestimmt Geber auf zuvor veröffentlichten Methoden mit einigen Änderungen. Kurz gesagt, wurde die Kollagenbildung in der Gallenblase anstelle der Gallengang injiziert. Dies geschah als eine Verbesserung um die Benutzerfreundlichkeit der Injektion zu erleichtern. Kollagenase-Infusion war gefolgt von Inkubation, Gewebe Störungen, gradient Dichtetrennung und Handlese, reine Inselchen zu erhalten. Inselchen wurden kultiviert über Nacht in CMRL-1066 Medium ergänzt mit 10 % Hitze-inaktivierten fetalen bovine Serum (FBS) in Korbflaschen T175 bei 37 ° C unter 95 % Luft – 5 % CO2 vor der Transplantation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Inselversetzung in die Leber über die Pfortader ist die am häufigsten verwendete Methode der Inselversetzung beim Menschen, aber es gibt noch Effizienz und Sicherheitsbedenken wie Portalader Thrombosis und Leber Steatose17. Neuere Studien zeigen, dass das Omentum eine geeignete Alternative zu der Leber, aber muss noch mehr Forschung vor der Übersetzung klinischer12,14,18,19…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Einige der Autoren dieser Arbeit wurden zum Teil durch Zuschüsse aus nationalen Schlüssel R & D Program of China (2017YFC1103704), Sanming Projekt der Medizin in Shenzhen (SZSM201412020), Fonds für High Level medizinische Disziplin Bau von Shenzhen (2016031638), unterstützt Shenzhen-Stiftung für Wissenschaft und Technologie (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556, JCYJ20160425110110658), Shenzhen Stiftung Gesundheit und Familienplanung-Kommission (SZXJ2017021).
Materials
| Equipment | |||
| 5 inch (12-13 cm) Scissors | RWD Life Science | S12030-11 | |
| Fine Forceps | RWD Life Science | F11010-13 | |
| Small wound clips | RWD Life Science | R33003-01 | |
| Acutenaculum | RWD Life Science | F31044-13 | |
| 2 pair tissue forceps | RWD Life Science | F13023-10 | |
| 4-0 Suture with needle | Chenghe, China | 17094 | |
| 200μl Pipette and tips | Gilson | PN11 | |
| One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
| razor blade | Philips | HC1099/15 | |
| Material and animals | |||
| Pentobarbital Sodium | Sigmaaldrich.com | P3761 | For anesthesia |
| Hydrogel | bdbiosciences.com | 356234 | Basement Membrane Matrix |
| Fibrin-Thrombin Hydrogel | Baxter.com | 1501250 | Components clot when mixed |
| 70% Ethanol | Yingniu medical, Anhui, China | 23170608 | |
| Iodophor | Lierkang medical technology, Shangdong, China | 170521 | |
| Normal saline | Baxter.com | 2B1324 | |
| Cephalosporin | Lukang medical, Shangdong, China | 150303 | |
| Cefazolin | Baxter.com | 2G3508 | |
| lubricant eye ointment | Major Pharmaceuticals | 203964 | |
| streptozotocin | Sigmaaldrich.com | S0130 | |
| collagenase Type V | Sigmaaldrich.com | C9262 | |
| CMRL-1066 media | celltrans, Wenzhou, China | X018D1 | |
| histopaque | Sigmaaldrich.com | 10771 | density gradient |
| PE50 tubing | Braintreesci.com | PE50 100 FT | Polyethylene .023" x .038 |
| Calcein AM | Sigmaaldrich.com | C1359 | |
| Propidium iodide | Sigmaaldrich.com | P4864 | |
| optimal cutting temperature compound (OCT) | Tissue-Tek; Miles, Naperville, IL | 4583 | embedding medium |
| insulin antibody | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 8138S | |
| hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology, Danvers, MA 01923 | 14166S | |
| eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific Inc. | D1306 | |
| C57Bl/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | / | |
| Fetal Bovine Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
| T175 flasks | Falcon | 353112 | |
| 1.5mL Snap-top tubes | Axygen | MCT-150-C |
References
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