인간의 치경과 파생 셀 Osteogenic 활동에 비타민 D의 효과에서 중간 엽 줄기 세포의 분리
Summary
선물이 파생 된 세포 (PDCs) 비타민 C (비타민 C) 및 1, 25-dihydroxy 비타민 D [1,25-(OH)2D3]에 의해 유도 된의 mRNA 식 biomarkers를 조사 하는 프로토콜. 또한, 우리는 osteocytes, chondrocytes, adipocytes에 차별 하는 Pdc의 능력을 평가 합니다.
Abstract
중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 다양 한 조직에에서 존재 하 고 osteoblasts를 포함 한 여러 세포 유형으로 분화 될 수 있다. MSCs의 치과 소스, 가운데는 레이어의 레이어에서 MSCs를 포함 하도록 확인 되었습니다는 쉽게 접근할 수 있는 조직입니다. 그러나,이 소스는 하지 아직 광범위 하 게 연구 되었습니다.
비타민 D3 와 1,25-(OH)2D3 생체 외에서 MSCs의 차별화를 실현 osteoblasts 자극 입증 되었습니다. 또한, 비타민 C는 콜라겐 형성과 뼈 세포의 성장을 촉진 한다. 그러나, 아무 연구는 MSCs에 비타민 D3 와 비타민 C의 효과 조사 아직 있다.
여기, 우리 인간의 치경과에서 MSCs를 분리 하는 방법을 제시 1,25-(OH)2D3 이 세포에 osteoinductive 효과 발휘 수 가설을 검사 하 고. 우리는 또한 인간의 치경과에서 MSCs의 존재를 조사 하 고 줄기 세포 접착 및 확산 평가. 평가 하기 위해 비타민 C (컨트롤)로 서의 능력 및 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−9, 10−8및 10−7 M)의 다양 한 농도 변경 키에 mRNA 생체 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산)의 고립 된 MSCs mRNA 표현 뼈 sialoprotein (BSP), 코어 바인딩 요소 알파-1 (CBFA1), 콜라겐-1, 및 osteocalcin (OCN) 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (RT-PCR)을 사용 하 여 측정 됩니다.
Introduction
비록 최근 몇 년 동안에서 수많은 관련 기술 개발 되었습니다, 뼈 재건 남아 여러 제약 조건에 의해 제한 하 고 필요한 재구성의 정도 종종 가능한 추정. 하드 조직 확대는 유리한 장기 성공률 뿐만 아니라 심 미와 기능 목표를 달성 해야 합니다. 이러한 절차에 대 한 일반적으로 사용 되는 방법에는 자생과 allogenic 뼈 접목, xenografting, 및 alloplastic 뼈 접목 포함 됩니다. 뼈 이식의 다양 한 종류 중에서 자생 뼈 이식 가장 효과적으로 간주 됩니다. 그러나, 기증자 사이트 사망률, 손상된 vascularity, 그리고 제한 된 조직 여부1 자생 뼈 접목에 대 한 주요 단점이 있다. 또한, allogenic 뼈 이식 술과 xenografts 되었습니다 관련 질병 전송 된. 현재, 합성 뼈 이식 이러한 문제를 해결 하기 위해 널리 사용 됩니다. 그러나, osteogenic 잠재력의 그들의 부족, 임상 결과 널리 다양 했습니다. 셀 룰 로스 등 재료는 볼륨 변동, 감염, 및 힘의 부족에 연관 된다.
사용 하 여 조직 공학 뼈 확대는 상당한 관심을 생성 했다. 이 기술에서는, 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 처음 사용 osteoblast 분화를 촉진 하는 다음 뼈 복구를 달성 하기 위해 뼈 손실의 사이트에 이식 됩니다. 이 절차는 현재 셀에 적용 됩니다. 제한 된 양의 조직 추출 하 여 뼈 재건을 달성은 간단 하 고 덜 침략 다른 방법에 비해입니다.
세포 기반 치료 치과 재생 목적을 위한 도구로 MSCs의 잠재적인 역할은 다양 한 연구 그룹 중 신흥 관심입니다. MSCs는 다음과 같은 유형의 조직에서 분화 될 수 있다 연구 확인: 골 수, 지방, 활 액 막, pericyte, 배수 뼈, 인간의 탯 및 치과 조직2,3. MSCs의 일반적인 소스는 골 수, 지방 조직, 그리고 치과 조직을 포함합니다. 지방 조직과 골 수에서 파생 된 MSCs와 비교는 치과 줄기 세포의 장점은 쉬운 접근성 및 더 적은 사망률 수확 후입니다. 배아 줄기 세포와 비교해, MSCs 치과 조직에서 파생 된 nonimmunogenic 나타나고 복잡 한 윤리적 문제3와 연결 되지 않습니다.
2006 년에, 세포 치료에 대 한 국제 사회 MSCs를 식별 하는 다음과 같은 표준을 사용 하 여 권장: 첫째, MSCs 수 있어야 합니다 플라스틱 연결. 둘째, MSCs CD105, CD73, CD90 표면 항 원에 대 한 긍정적이 고 부정적인 monocytes, 대 식 세포, B 세포는 조 혈 항 CD45와 CD344에 대 한 표식에 대 한 있어야 합니다. 최종 조건으로 MSCs는 다음 세 가지 유형의 차별화 생체 외에서 의 표준 조건 하에서 세포로 분화 할 수 있어야 합니다: osteoblasts, adipocytes, 및 chondrocytes4. 날짜 하려면, 6 종류 인간의 치과 줄기 세포의 고립 된 고 특징 되었습니다. 첫 번째 유형은 인간의 펄프 조직 으로부터 격리 되었고 출생 후 치과 펄프의 줄기 세포5되 나. 그 후, 치과 MSCs의 3 개의 추가적인 종류 고립 되었고 특징: 피부 박피 낙 엽이6,7치 주 인 대, 그리고 꼭대기 시8에서 줄기 세포. 더 최근에, 치과 여 포에서 파생 된9, gingival 조직 파생10, 치과 봉 줄기 cells(DBSCs)11, periapical 낭종 MSCs (hPCy-MSCs)12 도 확인 되었습니다.
세계적은 MSCs13정의 하는 첫번째 이었다. MSCs는 높은 확산 잠재력을 전시 하 고 이식 되 전에 분화를 조작할 수 있습니다 재생 절차10에 대 한 이상적인 후보자 다는 것을 건의 하.
비록 대부분의 연구는 줄기 세포의 원천으로 골 수를 사용 하 고과 파생 된 세포 (PDCs)도 있다14최근에 사용한. 과 골 보다 더 쉽게 접근할 수 있습니다. 따라서,이 기술을 사용 하 여 치경과 수술 중 추가 절 개에 대 한 필요성을 제거 하 고 환자의 postsurgical 사망률을 줄이기 위해. 과 결합 조직 하는 긴 뼈의 외부 안 대기를 형성 하 고 두 가지 계층으로 구성 됩니다: 외부 섬유 층 섬유 아 세포, 교원 질 및 탄력 있는 섬유15와 직접 접촉에서 내부 셀 풍부한 레이어의 레이어 구성 와 함께 뼈 표면. 레이어의 레이어에 포함 되어 있는 혼합된 셀 인구, 주로 섬유 아 세포16, osteoblasts17,18, pericytes 및 MSCs19,,2021로 식별 하는 중요 한 부분 모집단. 대부분의 연구는 Pdc는 비교를 하지 않을 경우 골 수 유래 줄기 세포 (bMSCs)에서 우수한 뼈 치유와 재생22,,2324을 보고 있다. 과 쉽게 접근할 수 이며 탁월한 재생 효과 전시. 그러나, 몇 가지 연구는과25,,2627에 집중 했다.
뼈 수리에 관한 현재 임상 실습 지원 건설 기계 내에서 증폭 periosteal 조상 세포의 이식 포함 됩니다. 최근 연구는 줄기 세포 결함이 지역에서 취득 하 고 조상 세포 조직 재생20채용에 집중 했다. 치과 의사는 또한 치 주 치료 및 치아에 치 주 뼈 재생의 미래 응용 프로그램을 예상합니다. 기증자 사이트에 대해서는 쉽게 일반 치과 의사에 의해 수확 될 수 있습니다. 이과 일상적인 구강 수술 하는 동안 액세스할 수 있습니다으로 골 수 기질 세포에 대 한 호의적으로 비교 합니다. 따라서,이 연구의 목적은 이다 형태학, 첨부 파일, 생존, 그리고 인간의 줄기 세포의 확산을 평가 하 고 수확 하는 Pdc에 대 한 프로토콜을 설정 하.
비타민 D 대사 산물에는 vivo에서 뼈 미네랄 동적 평형에 영향을. 한 연구 보고는 24R,25-(OH)2D3 활성 형태의 비타민 D 인간의 MSCs (hMSCs)28의 osteoblastic 감 별 법을 위해 필수적 이다. 뼈 항상성 및 수리는 1,25-(OH)의2D3 (calcitriol)은 생물학적으로 가장 적극적이 고 뼈 건강의 규칙에 관련 된 비타민 D3 대사 산물의 네트워크에 의해 규제 됩니다. 비타민 D3 석 회화29필수적 이다. 한 연구 2-d-오래 곤 흰 쥐를 사용 하 여, 쥐에서 embryoid 몸 비타민 C와 비타민 D 보충제 효과적으로 ESC 파생 osteoblasts30의 차별화 추진 표시. 다른 생물의 활동 중 1,25-(OH)2D3 osteoblasts, 모니터링할 수 있는 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 효소 활동이 나 OCN 유전자에는 증가에 따라에 hMSCs의 생체 외에서 분화를 자극 식입니다.
몇 연구 뼈 조직 공학에 특정 초점 인간의 Pdc에 결합된 치료 비타민 C와 1,25-(OH)2D3 의 복용량 응답 관계를 감지 했습니다. 따라서,이 연구에서 우리는 1,25-(OH)2D3 의 단일 또는 복합 치료에 대 한 최적의 농도 비타민 C 인간의 Pdc의 osteogenic 분화 유도 대 한 검사. 이 프로토콜의 목표는 치과 치경과에서 고립 세포 인구 세포와 MSC 표현 형이이 세포를 문화 (생체 외에서) 확장 하 고 원하는 조직을 형성 하기 위하여 분화 수 여부를 들어 있는지 확인 하는 . 또한, 우리는 osteocytes, chondrocytes, adipocytes에 차별 하는 Pdc의 능력을 평가 합니다. 연구의 두 번째 부분은 Pdc의 osteogenic 활동에 비타민 C와 10−10, 10−9, 10−8및 10−7 M 1,25-(OH)2D3 의 효과 평가합니다. 이 연구의 주 목적은 ALP 활동과 ALP, 같은 프로 osteogenic 유전자에 의해 Pdc의 osteoblastic 감 별 법 동안 비타민 C와 1,25-(OH)2D3 의 기능을 평가 하는 콜라겐 1, OCN, BSP, 및 CBFA1. 또한,이 연구는 이러한 결과에 따라 인간의 Pdc에 대 한 최적의 osteoinductive 조건을 결정 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
최근에 개발한 치료 양식 적임, 즉 조직 MSCs, 수 반하는 공학에 수많은 장점이 있습니다. 여러 조직 종류에 있는 MSCs 기능 mesodermal 조직 세포37 의 다양 한 차별화 수 있는 multipotent 셀과 다른 셀 osteoblasts 등 있습니다.
과 조상 세포에 대 한 틈새 시장으로 하며 뼈에 대 한 풍부한 맥 관 구조 공급으로38을 포위 한다. 34 조사 샘플의 우리의 연구?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
연구 프로토콜은 임상 연구의 장 궁 기념 병원 (IRB99-1828B, 100-3019 C, 99-3814B, 102-1619 C, 101-4728B, 및 103-4223 C)에 대 한 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었다. 이 연구는 장 궁 기념 병원 (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142, 및 NMRPG3C0151)에 의해 지원 되었다. 이 원고는 월 러 스 학술 편집 편집 했습니다.
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 2-phospho-L-ascorbic acidtrisodium salt | Sigma | 49752 | |
| 35-mm culture dishes | Corning | 430165 | |
| 3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Alkaline phosphatase | ABI | Hs01029144_m1 | |
| Alkaline Phosphatase Activity Colorimetric Assay Kit | BioVision | K412-500 | |
| avian myeloblastosis virus reverse transcriptase | Roche | 10109118001 | |
| CD146 | BD | 561013 | |
| CD19 | BD | 560994 | |
| CD34 | BD | 560942 | |
| CD44 | BD | 561858 | |
| CD45 | BD | 561088 | |
| CD73 | BD | 561014 | |
| CD90 | BD | 561974 | |
| Cell banker1 | ZEAOAQ | 11888 | |
| core binding factor alpha-1 | ABI | Hs00231692_m1 | |
| dexamethasone | Sigma | D4902 | |
| DPBS | Gibco | 14190250 | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| GAPDH | ABI | Hs99999905_m1 | |
| HLA-DR | BD | 562008 | |
| indomethacin | Sigma | I7378 | |
| insulin | sigma | 91077C | |
| insulin–transferrin–selenium-A | Sigma | I1884 | |
| MicroAmp Fast 96 well reaction plate(0.1ml) | Life | 4346907 | |
| MicroAmp optical adhesive film | Life | 4311971 | |
| Minimum Essential Medium 1X Alpha Modification | HyClone | SH30265.02 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Permeabilization buffer | eBioscience | 00-8333-56 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360070 | |
| STRO-1 | BioLegend | 340103 | |
| SYBER Green PCR Master Mix | AppliedBiosystems | 4309155 | |
| TaqMan Master Mix | Life | 4304437 | |
| transforming growth factor-β | Sigma | T7039 | |
| Trizol reagent (for RNA isolation) | Life | 15596018 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
| collagen-1 | Invitrogen | forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3 | |
| reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3' | |||
| OCN | Invitrogen | forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3' | |
| reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3' | |||
| BSP | Invitrogen | forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3' | |
| reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3' | |||
| Commercial ALP primers | |||
| Commercial CBFA1 primers |
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